Mol Cell︱细胞周期调控的新机制

撰文 | 咸姐

细胞周期的一个关键功能是确保基因组在细胞进行染色体分离之前完全复制，几十年来，细胞如何监测DNA复制的进展以防止过早进入有丝分裂一直是细胞周期领域的首要问题。虽然研究表明，酵母中的细胞周期检查点由Mec1和Rad53激酶控制，在防止过早有丝分裂中起关键作用 【1】 ，但是这种作用在人类中还不太清楚。Mec1和Rad53在人类中的同源物分别是ATR和CHK1，被发现是复制应激 （ RS ） 和DNA损伤的关键应答因子 【2】 ，但是，在正常条件下，它们在S期也具有活性，在整个S期，细胞依赖这种ATR/CHK1活性来限制CDK2活性并调节复制起点的触发。此外，有研究发现ATR/CHK1可以通过限制CDK1的活性，延缓有丝分裂因子的转录和有丝分裂激酶的激活，从而防止过早过渡到G2期和有丝分裂。由于这种内在活性依赖于活跃复制叉处的单链DNA （ssDNA） 的存在，因此ATR/CHK1实现了一个DNA复制监测系统，以确保CDK1活性在基因组完全复制之前受到抑制 【3】 。然而，ATR/CHK1防止提前进入有丝分裂的能力相当有限，仅限于S期的晚期阶段，而且有研究发现在ATR/CHK1活性缺失的情况下，有些细胞可提前进入G2/M期，但大多数细胞仍处于S期，这意味着与DNA复制相关的其他过程可能参与了S期与G2/M期的分离的调节。

近日，来自丹麦哥本哈根大学的Luis Toledo团队在Molecular Cell在线发表题为  The TRESLIN-MTBP complex couples completion of DNA replication with S/G2 transition  的文章， 发现TRESLIN-MTBP复合物可监测复制起点的触发而将DNA复制与S期向G2期的及时过渡偶联起来，以此揭示了哺乳动物中一个独立于经典ATR/CHK1通路的可防止从早期S期过早进入G2期的细胞周期调控的关键功能。

有研究发现，在斑马鱼中，ticcr基因产物TRESLIN可以阻止从S期进入有丝分裂，而在人类中，TRESLIN及其伴侣MTBP是复制起始触发的关键，这一过程需要若干蛋白质被顺序招募到复制前复合体 （preRC） 中。然而，TRESLIN是如何调节细胞周期进程的，以及这是否与DNA复制有关，仍有待探索。

为了研究人类TRESLIN在细胞周期进程中的作用，本文研究人员首先设计了一种基于定量图像的流式细胞术 （QIBC） 对单个细胞中S-G2/M转换进行定量分析的方法。利用该方法，研究人员对细胞进行成像，量化DAPI强度 （以确定DNA含量） 、EdU掺入 （以监测DNA复制） 和组蛋白H3在第10个丝氨酸上的磷酸化水平 （H3-Ps10用于可视化有丝分裂进入） ，以此精确地识别出不同步生长细胞的G1、S、G2和M期，同时量化细胞周期蛋白B1 （cyclin B1） 的水平以显示G2期的进入，结果显示存在一种紧密的控制机制可以将DNA复制的结束与G2期的开始偶联在一起。当敲低TRESLIN或MTBP时，研究人员发现整个S期cyclin B1和H3-Ps10表达都异常高，CDK的活性也异常高，由此表明TRESLIN-MTBP复合物可防止细胞周期的过早进展。而进一步的实验结果显示，TRESLIN的缺失本身并不会导致有丝分裂的进入，而是从早期S期开始，导致DNA复制和细胞周期进程的广泛解偶联。

为了进一步了解TRESLIN缺失对细胞周期的影响，研究人员通过QIBC分析了cyclin E1和A2的表达。在对照细胞中，cyclin E1在G1期最高，在S期逐渐降解，而cyclin A2在G1期退出后增加，在G2期达到峰值。但是TRESLIN的缺失导致这些表达谱发生了显著变化，在S期开始时，cyclin E1就降解了，cyclin A2则已经积累。有趣的是，TRESLIN缺失细胞的S期时的蛋白表达类似对照细胞的G2期，表明这些细胞过早地进入了真正的G2期。在TRESLIN缺失的细胞中，有丝分裂的进入依赖于PLK1的活性，并引起广泛的ssDNA积累和DNA损伤，提示大量的复制叉断裂。

有研究发现，TRESLIN过表达可在体外促进ATR的活化，因此，有人认为TRESLIN可能在ATR上游起作用，然而，本文研究人员发现损伤TRESLIN和损伤ATR/CHIK通路对细胞周期的影响是不同的。尽管ATR活性升高，但TRESLIN缺失可触发S期旁路，而ATR/CHIK通路可抑制TRESLIN缺失细胞中的CDK1活性和有丝分裂进入。所有实验结果均证实，TRESLIN和ATR/CHK1在细胞周期调控中发挥互补作用，尽管ATR/CHIK介导的CDK抑制对于延迟向有丝分裂的过渡非常重要，但TRESLIN-MTBP主导了DNA复制与G2期进入之间的协调，而且TRESLIN对细胞周期的控制与DNA合成水平无关。值得一提的是，TRESLIN缺失对细胞周期进程的影响比它对DNA复制的影响更严重，这表明存在不同的TRESLIN库，其中很大一部分是阻止向G2期过渡所必需的。进一步地实验数据表明，TRESLIN对S/G2期转换的控制依赖于其通过CDC7信号通路结合染色质和复制起点的能力，要使S/G2检查点发挥作用，TRESLIN-MTBP必须被招募到preRC （通过CDC7） ，随后在CDC45的作用下释放。通过这种方式，TRESLIN-MTBP将能够定量地感知复制起点激发的速率，当其较高时刻保持检查点“打开”，而当其低于S期结束的阈值时则关闭检查点。

综上所述， 本研究证明TRESLIN-MTBP复合物拥有同时促进DNA复制和抑制进入G2期的控制能力 ，直到基因组被晚期复制；揭示了将这两种功能在复制起始激活的早期阶段连接起来的方式，即通过CDC7将TRESLIN-MTBP招募到preRC，随后CDC45和CDK活性促进其释放，以此使得细胞能同时促进并监测复制起点的激发，同时指出 TRESLIN-MTBP和ATR/CHK1在控制S/G2/M转换方面具有互补作用 ，从而 为哺乳动物细胞周期的控制提供了一个全新的视角。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.08.006

制版人：十一

参考文献

1. Labib, K., and De Piccoli, G. (2011). Surviving chromosome replication: the many roles of the S-phase checkpoint pathway. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 366, 3554–3561.

2. Zeman, M.K., and Cimprich, K.A. (2014). Causes and consequences of replication stress. Nat. Cell Biol. 16, 2–9.

3. Saldivar, J.C., Hamperl, S., Bocek, M.J., et al. (2018). An intrinsic S/G2 checkpoint enforced by ATR. Science 361, 806–810.

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