Cell︱识别肿瘤微环境调节因子的新方法——空间CRISPR基因组学

撰文 | 咸姐

肿瘤的细胞组成、空间结构和组织定位对癌症的进展和治疗反应有着重要的影响，而这些因素与肿瘤免疫尤其相关，因为肿瘤微环境 (TME) 内的免疫细胞组成和定位是免疫治疗反应和患者预后的主要决定因素之一【1】。空间分辨的单细胞基因组测序结果表明，肿瘤附近存在着许多遗传上不同的亚克隆，并且可能具有不同的TME组成【2】，但是，特定基因如何影响TME、相邻克隆如何互相影响的都尚不清楚。事实上，虽然目前已经发现了一些参与协调 TME 的基因，但许多基因在影响不同肿瘤的结构和免疫组成方面的潜在作用均尚未确定。

TME的组成是相当复杂的，由许多不同的免疫和非免疫细胞类型组成，它们的比例、位置和运动都是相互依赖的因素。许多基因的功能取决于组织的环境以及与特定细胞类型和结构的空间接近程度【3】。此外，虽然CRISPR筛选有助于发现调节许多细胞内在过程的基因，但是现有方法对于识别细胞外的基因功能并不理想，尤其是在组织环境中。因此，从肿瘤中表达的成百上千的基因中识别出会影响TME的组成和排列的基因是一个巨大的挑战。

近日，来自美国西奈山伊坎医学院的Brian D. Brown团队在Cell上在线发表题为 Spatial CRISPR genomics identifies regulators of the tumor microenvironment 的文章，开发了一种新的空间功能基因组学方法——“扰动图谱（Perturb-map）”，结合CRISPR库、多重成像和空间转录组学，以识别肿瘤组成、组织和免疫的遗传决定因素，从而在保留了空间结构的同时，以单细胞分辨率为组织内的功能基因组学建立了Perturb-map，并为癌细胞的TGFβ反应性如何影响TME提出了新的见解。

Pro-Code系统是一种基于蛋白质的载体/细胞条形码系统，由与支架蛋白dNGFR融合的线性表位（如FLAG、HA等）的三联体组合组成。本文研究人员首先构建了表达不同Pro-Code的肺癌（Kras^G12D以及p53缺失的KP肺癌）和乳腺癌（4T1）细胞系，以此构建小鼠的肺癌和乳腺癌模型，通过多重成像原位检测实现了在单细胞分辨率和组织规模下，检测到肿瘤内120种不同的 Pro-Code 表达的癌细胞群，并且显示了肺癌和乳腺癌的克隆性，证实了每种肿瘤背景的不同空间模式——KP 肺癌具有高克隆性和低混合性，4T1 原发性肿瘤具有弥漫性克隆性，4T1肺转移瘤则呈克隆性发展，但也存在混合性转移。

那么是否可以利用Pro-Code创建一个用于原位解析CRISPR筛选的平台呢？答案是肯定的，即Perturb-map——基于蛋白质条形码（Pro-Code）系统，利用少量线性表位的三重组合来创建一组更高阶的独特条形码，从而可以标记表达不同CRISPR gRNA的细胞。

研究人员构建了一个靶向35个基因的核Pro-Code（nPC）/CRISPR慢病毒载体（LV）文库，并将其应用于小鼠肺癌模型中，这些基因编码细胞因子信号通路的调节因子（包括IFNα、IFNγ、TGFβ和TNFα的受体）以及参与免疫细胞相互作用的配体和分泌因子，并且参与了与人类对癌症免疫疗法的反应相关的途径。研究人员使用 Pro-Code 鉴定来确定每个肿瘤中表达的 CRISPR，在注射了nPC/CRISPR KP 细胞的 11 只小鼠中确定了约1,750 个不同的 Pro-Code 表达肿瘤。为了确定靶基因是否影响体内肿瘤的发展，研究人员首先比较了携带特定nPC/CRISPR的肿瘤比例与预注射细胞混合物中相同nPC/CRISPR的相对频率。结果显示许多 nPC/CRISPR 的频率发生了显着变化，提示相关基因影响肿瘤生长。研究人员还发现除了能够测量与基因敲除相关的肿瘤病变的数量和面积外，Perturb-map还有助于评估不同基因对肿瘤结构的影响。基于Perturb-map的结果，研究人员发现TGFβ受体2（Tgfbr2）基因和Socs1基因的敲除（KO）均具有生长优势，但是前者会导致基质重塑并诱导高纤维粘液性肿瘤的发展，而后者则与两种低分化的肿瘤病变类型——胸膜斑块和鳞状肿瘤的发生相关，由此表明Tgfbr2 和 Socs1 的缺失以截然不同的方式改变了 KP 肺肿瘤的结构。

随后，研究人员又证实，利用Perturb-map可以研究不同基因对肿瘤病灶内和周围免疫细胞的的招募和维持的影响。以在体内均富集的Tgfbr2 KO和Socs1 KO损伤为例，两者显示出相反的免疫组分模式，Tgfbr2病灶明显排除免疫细胞，尤其是CD4⁺和CD8⁺ T细，而Socs1病灶则表现出高度T细胞浸润。除了量化免疫浸润外，Perturb-map还可以用于评估每个肿瘤病灶内免疫细胞的空间分布。一般来说，免疫细胞更集中在肿瘤的外部区域，尤其是 CD4⁺和CD11c+ 细胞，然而，研究人员发现在特定的KO病变中存在显著差异。此外，通过Perturb-map研究相邻肿瘤是否影响彼此的免疫浸润，研究人员发现，毗邻Socs1 KO肿瘤的肿瘤病灶并不倾向于显示更高的T细胞浸润，而毗邻Tgfbr2 KO肿瘤的肿瘤病灶的T细胞也没有更多地被排除，由此表明，至少在IFNγ和TGFβ通路改变的情况下，在彼此紧密接触的肺肿瘤病变中，免疫细胞的组成和空间排列是非常局部的。这些结果也证实，Perturb-map提供了一种规模化的方法来评估特定的基因改变如何影响局部、近端和远端 TME 状态。

进一步地，研究人员将空间转录组与Perturb-map配对结合，以确定不同基因扰动对肿瘤状态的影响，结果证实其可以识别与基因扰动相关的分子特征。深入分析表明，KP肺癌细胞中Tgfbr2的缺失的一个结果是肿瘤中TGFβ表达增加以及TME中TGFβ通路的激活，这提示在Tgfbr2 KO病灶中观察到的基质重塑和免疫排斥的潜在机制是肿瘤相关成纤维细胞的TGFβ的激活。由此也证实，空间转录组学整合到Perturb-map中，可以以空间分辨的方式提供不同基因扰动的无偏倚分子分析。

最后，研究人员通过小鼠肺癌模型，在体内验证了与Tgfbr2 KO肿瘤相关的Perturb-map表型。实验结果显示，与Perturb-map的观察结果一致，与对照病灶相比，Tgfbr2 KO肿瘤的病灶明显增大，覆盖肺部区域也明显增多，而且许多 Tgfbr2 肿瘤具有纤维粘液基质，Tgfbr2 肿瘤内CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润也显着减少，由此证实了Tgfbr2的缺失重塑了KP肺癌的TME。

综上所述，本研究建立了一种功能基因组学方法——Perturb-map，能够通过多重成像和空间转录组学在组织内实现混合CRISPR筛选，其关键优势在于它拓宽了可以在功能基因组筛选中研究的基因类型和基因功能。通过对组织中的Pro-Code进行成像，Perturb-map不仅有助于评估不同基因扰动对肿瘤生长的影响，也有助于评估不同基因扰动对肿瘤形态和免疫细胞招募的影响。除了能够用来研究特定基因的功能，Perturb-map还能用于研究特定基因扰动和相关表型对邻近肿瘤区域的影响。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.02.015

制版人：十一

参考文献

1. Binnewies, M., Roberts, E.W., Kersten, K. et al. (2018). Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat. Med. 24, 541–550.

2. Mitra, A., Andrews, M.C., Roh, W., De Macedo et al. (2020). Spatially resolved analyses link genomic and immune diversity and reveal unfavorable neutrophil activation in melanoma. Nat. Commun. 11, 1839.

3. Haigis, K.M., Cichowski, K., and Elledge, S.J. (2019). Tissue-specificity in cancer: The rule, not the exception. Science 363, 1150–1151.

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