Cell Metab | 李海廓等构建肾脏纤维化全景图谱并揭示上皮损伤反应机制

1200多年前，年老体衰的杜甫在晚年登高望远，面对长江，曾发出“无边落木萧萧下，不尽长江滚滚来”的感慨。机体衰老的一个重要现象是慢性肾脏病 （Chronic Kidney Disease） 的发生，该疾病通常还会由心血管疾病、糖尿病、急性损伤和遗传等多因素诱导发生，其核心通路是肾脏纤维化。在中国，慢性肾脏病在成人群体中的发病率高达10.8%，预估有超过1亿患病人口 【1】 。然而，除透析和肾移植之外，目前仍无有效针对晚期慢性肾脏病的临床疗法。

为更好地研究肾脏纤维化过程中的分子和代谢机制，2022年10月19日，华盛顿大学医学院Benjamin Humphreys实验室的博士生李海廓 （第一作者） 和合作者在Cell Metabolism上发表了文章 Comprehensive single-cell transcriptional profiling defines shared and unique epithelial injury responses during kidney fibrosis ， 利用高通量单细胞测序技术sci-RNA-seq3以及系统的组织学和细胞代谢方法，对两种不同的小鼠肾脏纤维化模型进行了全时间尺度的单细胞转录组鉴定，并发现全新的肾脏上皮细胞的损伤应答和代谢修复机制 【2】 。

研究人员对肾脏缺血再灌注模型 （renal ischemia-reperfusion injury, IRI） 和单侧输尿管结扎模型 （unilateral ureteral obstruction, UUO） 这两个小鼠肾脏纤维化模型的早期、中期、晚期进行了全时间尺度的鉴定，总计涉及11个时间点和24个样本。尽管单细胞转录组测序 （single-cell RNA sequencing, scRNA-seq） 技术在近些年获得了显著的普及和应用 【3】 ，常规scRNA-seq方法往往受限于样本量、细胞通量、批次效应（batch effects）以及较高的经费成本，无法满足作者在这份研究中的多样本、高通量的需求。因此，研究人员采用了sci-RNA-seq3这一全新的scRNA-seq技术 （最初由Jay Shendure实验室的曹俊越博士等于2019年报道 【4】 ） ，并针对小鼠肾脏组织进行了特异性的技术优化，最终成功在一个批次实验中完成了对24个小鼠样本的转录组文库构建并获得了超过30万个高质量细胞。通过单细胞聚类分析，研究人员报道了50种不同的细胞类型或细胞态，涵盖整个肾脏上皮、内皮、基质和免疫系统。

工作模型

单细胞图谱可视化

值得注意的是，研究人员发现了两类全新、未被报道过的近端小管 （proximal tubule, PT） 的损伤型细胞态，并命名为一类损伤PT和二类损伤PT。这两类细胞态主要分别分布于IRI模型的前期和UUO模型的前中期，暗示这两类细胞在肾脏上皮损伤的细胞命运决定中可能发挥重要作用。下游分析进一步暗示这两类细胞态具有不同的脂肪代谢和氨基酸代谢的通路机制。

研究人员进一步发现，一类损伤PT细胞呈现出显著激活的脂肪代谢通路、脂肪酸氧化 （fatty acid oxidation, FAO） 活性和脂滴 （lipid droplet） 基因上调。值得注意的是，这种激活型脂肪通路宛若“昙花一现”——它短暂地出现于IRI损伤后的6小时之内，并在损伤后的第2天几乎完全消失——这一发现颠覆了长久以来公认的肾脏纤维化中脂肪代谢是被抑制的概念 【5】 。

研究人员继而通过组织培养、药物抑制、氧气消耗/氢离子测量、空间转录组学等方法，系统地证明了该脂肪通路的激活，并报导了PLIN2蛋白是该脂肪通路中lipid droplet的生物标志物。通过对人类PT细胞进行体外脂肪酸处理，研究人员发现PLIN2能在6小时内实现超过10倍的上调。通过对PLIN2基因的遗传学敲落 （knock-down） ，作者发现了在脂肪积累过程中下调的氧气利用率和FAO活性，以及上调的细胞自噬和线粒体分裂，揭示PLIN2在肾脏上皮细胞的代谢和能量调控中的重要功能。值得注意的是，PLIN2长久以来被认为是一个经典的脂肪细胞基因，然而该论文研究人员首次报导了该基因在肾脏损伤的作用。

PLIN2时空间表达形态

利用该超过30万细胞的肾脏纤维化单细胞图谱，论文作者进一步挖掘了除PT细胞以外的肾管状上皮细胞 （tubular epithelial cells （TECs），包括亨利式环、远曲小管、连接管细胞等） 的损伤机制。研究人员发现这些TECs表现出和PT细胞相似的上皮损伤反应——这些细胞都存在损伤型细胞态和纤维化基因通路的激活。此外，在肾脏纤维化的全时间尺度上，这些TECs呈现出和PT细胞类似的损伤和修复动态，揭示各种肾小管的各类上皮细胞存在保守统一的损伤应激表型。最后，研究人员解析了基质细胞 （包括成纤维细胞和肌成纤维细胞） 在基因表达、空间分布和功能方面的异质性，并阐释了基质细胞和肾脏上皮细胞的互作对肾脏纤维化的影响。

综上所述，论文作者利用新型单细胞转录组技术构建了高通量肾脏纤维化全景图谱，并通过系统生物学方法发现了新型损伤型细胞态，阐释了脂肪代谢在肾脏纤维化中的动态调节作用。

论文图片摘要

本文通讯作者圣路易斯华盛顿大学Humphreys博士长期致力于组织纤维化和基因组学在疾病发生中的研究和应用。本文第一作者李海廓博士表示，利用新型文库构建技术能够帮助研究人员摆脱传统方法的技术限制，例如在该研究中，他们将sci-RNA-seq3单细胞文库构建方法应用于疾病模型，并为临床转化提供了新型潜在靶点 （欢迎各位学者老师通过邮件haikuo.li@wustl.edu进行学术交流和合作） 。

原文链接：

https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(22)00450-8

制版人：十一

参考文献

1. Zhang, Luxia, et al. "Prevalence of chronic kidney disease in China: a cross-sectional survey." The lancet 379.9818 (2012): 815-822.

2. Li, Haikuo, et al. "Comprehensive single-cell transcriptional profiling defines shared and unique epithelial injury responses during kidney fibrosis." Cell Metabolism online ahead of print.

3. Li, Haikuo, and Benjamin D. Humphreys. "New functions for basophils identified in kidney fibrosis." Nature Immunology 23.6 (2022): 824-825.

4. Cao, Junyue, et al. "The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis." Nature 566.7745 (2019): 496-502.

5. Kang, Hyun Mi, et al. "Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development." Nature medicine 21.1 (2015): 37-46.

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