Sci Adv丨叶岚、周坚、林明焰揭示YTHDC2-RBM46-MEIOC蛋白复合物参与减数分裂调控

减数分裂是有性生殖生物特有的一种细胞分裂方式。在视黄酸信号诱导下，STRA8和转录因子MEIOSIN能协同作用启动减数分裂。然而，体外过表达减数分裂起始的转录复合物STRA8/MEIOSIN不能有效启动减数分裂和沉默有丝分裂相关的转录本，提示减数分裂的启动可能由多层调控机制介导。

以N6-甲基腺苷 （ m6A ） 为代表的RNA修饰近年来受到广泛关注和研究，属于转录后调控的重要机制，在调控基因表达中发挥着关键作用。m6A对于mRNA转录、剪切和翻译等过程的调控依赖于其识别蛋白 （m6A reader） 。在哺乳动物细胞内，目前发现有5种比较重要的m6A readers，包括YTHDF1/YTHDF2/YTHDF3以及YTHDC1/ YTHDC2。其中YTHDC2属于RNA依赖性解旋酶DExH家族，包含结合m6A的YTH结构域和RNA解旋结构域，大量表达于雄性生殖细胞。

2017年，来自芝加哥大学何川 【1】 、日内瓦大学Ramesh Pillai 【2】 和纪念斯隆凯瑟琳癌症中心Scott Keeney 【3】 等课题组报道了YTHDC2与生殖细胞特异蛋白MEIOC形成蛋白复合物，在调控哺乳动物减数分裂起始中发挥重要的功能。但具体的分子机理还不是很清楚。2021年，宾夕法尼亚大学Jeremy Wang课题组利用诱导性敲除模型，进一步揭示YTHDC2不仅在减数分裂起始阶段，而且在减数分裂粗线期精母细胞发育阶段发挥功能 【4】 。2022年3月，罗格斯大学Devanshi Jain 【5】 和日内瓦大学Ramesh Pillai 【6】 课题组陆续在Genes & Development和Molecular Cell杂志报道了YTHDC2优先结合RNA 3′ 端的U-rich motifs。与传统预期模式不同，研究者们意外发现YTH点突鼠可繁育，证实YTHDC2识别m6A的能力与其生物学功能无关，而其解旋酶活性主要介导了YTHDC2在哺乳动物生殖细胞发育中的作用。YTHDC2蛋白本身是一种RNA解旋酶，尽管对它解旋酶活性的重要性有了进一步认识，但YTHDC2/MEIOC蛋白复合物如何靶向转录本的分子机理还不是很清楚。体外实验显示YTHDC2蛋白以一种不依赖RNA序列的方式结合和解旋其RNA底物，提示YTHDC2蛋白复合物中有其他成员协同完成。

2022年8月24日，南京医科大学生殖医学国家重点实验室叶岚课题组，无锡市儿童医院周坚课题组和南京医科大学林明焰课题组合作在Science Advances发表了题为 RNA-binding protein RBM46 regulates mitotic-to-meiotic transition in spermatogenesis 的研究成果， 系统筛选和发现YTHDC2蛋白复合物成员RBM46蛋白特异靶向RNA底物，提出YTHDC2-RBM46-MEIOC蛋白复合物，与果蝇Bgcn-Tut-Bam复合体类似，形成一种古老的转录后调控机制，在减数分裂起始阶段沉默有丝分裂相关的转录本。

为了寻找YTHDC2复合物的重要成员，研究人员先后收集出生后12天龄和21天龄的小鼠睾丸， 富集内源性YTHDC2复合物，随后的质谱分析确定RBM46是一个重要的YTHDC2相互作用蛋白，且RBM46以不依赖RNA的方式与YTHDC2结合。通过体外过表达和制备重组蛋白，进一步发现RBM46不能与YTHDC2直接结合，提示YTHDC2复合物中其他成员介导了RBM46-YTHDC2的相互作用。

RBM46是Drosophila Tut的脊椎动物同源体，在睾丸中优势表达，其mRNA转录本和蛋白在减数分裂起始阶段增高，并在精母细胞中高度表达。在此项研究中，为了探究RBM46在精子发生过程中的功能和机制，研究人员制备了Neurog-cre介导的生殖细胞特异性Rbm46敲除鼠模型。敲除小鼠呈现生殖管腔中大量精母细胞丢失，大部分生精管腔阻滞在前细线期 （preleptotene） 阶段，一些前细线期精母细胞过早发育和成熟进入中期 （metaphase） 阶段，出现无精和不育的表型。基于此，研究人员得出结论，RBM46调控减数分裂的起始，是维持小鼠正常生殖发育的重要蛋白，其表型与敲除Ythdc2或Meioc基本相似。

Ccna2是一种典型的有丝分裂转录本，其编码蛋白有效驱动有丝分裂S期和G2-M期的进展。CCNA2在有丝分裂期精原细胞和前细线精母细胞的雄性生殖细胞系中表达，通常在进入减数分裂后的细线期精母细胞中下调。免疫荧光染色发现，CCNA2在条件性Rbm46敲除鼠的精母细胞异常高表达，进一步分析出生10天龄的野生型和条件性Rbm46敲除鼠转录组等发现Ccna2转录本上升。也就是说，异常表达的有丝分裂转录本在Neurog-cre Rbm46 敲除鼠睾丸中存在，进而干扰了生殖细胞由有丝分裂向减数分裂的转变。

为了研究RBM46调控哺乳动物生殖细胞分裂发育的机理，研究人员首先想要知道在这些细胞中，那些转录本是直接受到RBM46调控的。为此研究人员运用增强型共价交联免疫沉淀 （eCLIP） 技术鉴定其靶向结合的RNA。通过数据分析，发现RBM46高度结合RNA 3′ 端，特异性识别和结合含“AAUCAUGU”motif的转录本。体外EMSA实验进一步表明其靶向结合RNA具有序列“AAUCAUGU”的偏好性。基于最近文献报道的YTHDC2 iCLIP和YTHDC2 CLIP实验结果，YTHDC2优先结合RNA 3′ 端的U-rich motif。研究人员将RBM46 eCLIP与已知的YTHDC2 CLIP靶向转录本及结合位点进行联合分析，发现YTHDC2和RBM46共同结合RNA 3′ 端。出生10天龄和成年小鼠睾丸的YTHDC2 CLIP-seq中，YTHDC2除了结合U-rich motif， 同时富集RBM46结合的 “AAUCAUGU”motif。为了确定RBM46和YTHDC2结合位点的相对位置和距离，研究人员首先在它们共同靶向的mRNA 3' UTR的U-rich motif两侧相邻区域 （±100 nt） 内扫描了其它潜在motifs。motif富集分析显示存在RBM46靶向结合“AAUCAUGU”序列，被确定为最富集的motif。此外，RBM46 eCLIP数据中，RBM46靶向结合“AAUCAUGU”motif的两侧相邻区域内同时富集U-rich motif。YTHDC2 CLIP信号在3' UTR末端附近显著富集，观察到RBM46与位于YTHDC2结合位点上游5′ 区域的结合增加。上述分析表明RBM46和YTHDC2结合的RNA结合位点十分接近，提示它们可能在同一个蛋白复合体中靶向结合并调控有丝分裂相关RNAs的降解。

RBM46-MEIOC-YTHDC2复合体调控减数分裂起始的示意图

论文的第一作者为南京医科大学生殖医学国家重点实验室的钱宝梅博士，南京医科大学生殖医学国家重点实验室叶岚教授、无锡市儿童医院周坚研究员和南京医科大学林明焰教授为本文共同通讯作者。

原文链接：

http;//doi.org/10.1126/sciadv.abq2945

制版人：十一

参考文献

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