从原料出发，如何加速mRNA疫苗开发及生产

当前，全球疫情局势依然严峻，由于病毒的不断变异，各国陷入了与新冠病毒持久的斗争中，同时也引起了人们对于“变异病毒是否会让新冠疫苗失效”的担忧。

 

对于变异株，mRNA疫苗目前依然具有较好的保护效力。6月22日，《新英格兰医学杂志》（NEJM）发表的真实世界数据结果显示，完成2剂BNT162b2 mRNA疫苗后，预防德尔塔变异株的保护率为88%。

 

另外，辉瑞近期公布的Q2财报显示，mRNA疫苗加强针会在很大程度上提升抗体水平。对于德尔塔变异株，第三剂接种后，中和滴度比第二剂接种后增加了5~11倍。

 

图片来源：辉瑞

 

Moderna同样在近期财报中公布了加强剂疫苗的数据，显示在接种第三剂疫苗后，针对德尔塔的几何平均滴度（GMT）提高42.3倍。

 

• 2021年8月12日，美国FDA更新了mRNA新冠疫苗BNT162b2（辉瑞/BioNTech/复星）和mRNA-1273（Moderna）的紧急使用授权 (EUA)，允许免疫功能低下人群接种第三针疫苗。

 

• 2021年8月23日，mRNA疫苗COMIRNATY®（BNT162b2）还获美国FDA批准上市，用于在16岁及以上的人群中使用以预防新型冠状病毒感染，成为首款获得FDA正式批准上市的新冠疫苗。

 

不过，如果未来出现当前疫苗不足以应对的新变异病毒，也将需要开发疫苗的新版本。而mRNA技术路线在未来可能的新一轮疫苗开发中，依然具有很大的优势。mRNA疫苗制备方便，抗体浓度极高，同时也结合了理想的免疫原性和突出的安全性。更为重要的是，mRNA疫苗对待变异病毒变异具有快速反应能力，可以迅速跟上病毒突变的速度。

mRNA疫苗平台的灵活性有利于制造，以至于研发新疫苗，只需要重编码抗原，其他工艺不需要改变，可以标准化生产；生产商也无需花太多时间等待监管者审批。BioNTech相关负责人曾表示，可以在几天内改变疫苗中mRNA的序列；原则上，可以在6周内交付新疫苗。

图片来源：nytimes.com

 

国内mRNA领域持续升温

一场新冠疫情，让mRNA技术成功“出道”，成为全球市场最受关注的投资赛道之一。根据WHO数据，全球共有十余款mRNA新冠疫苗在临床试验阶段，其中包括已得到广泛应用的BNT162b2和mRNA-1273。

 

国内目前获得新冠mRNA疫苗临床批件的企业包括复星医药、艾博生物、斯微生物和丽凡达生物。

 

• 2021年3月16日，珠海丽凡达生物研制的新型冠状病毒mRNA疫苗获得国家药监局（NMPA）核准签发的《药物临床试验批件》，正按计划启动临床试验。该疫苗为继沃森生物以及斯微生物之后的第三款国产新冠mRNA疫苗。

 

• 2021年3月25日，由斯微生物、同济大学附属东方医院合作研发的mRNA新冠疫苗的I期临床试验正式启动。

 

• 2021年6月1日，斯微生物宣布正式完成近2亿美元新一轮融资。

 

• 2021年7月14日，复星医药董事长兼CEO吴以芳在股东大会上回复投资人问询时表示，中国国家药监局对mRNA新冠疫苗“复必泰”的审定工作已经基本完成，专家评审已经通过，目前正在加紧进行行政审批阶段。

 

• 2021年7月21日，沃森生物和艾博生物合作研发的mRNA新冠疫苗（ARCoV）在中国临床试验网上登记了国内3期临床研究信息。这是国产mRNA疫苗开展的首个3期临床试验。

 

• 2021年8月19日，艾博生物宣布完成总额超过7亿美元的C轮融资。

 

近年来，国内mRNA市场不断升温，复星、艾博、斯微和丽凡达在新冠疫苗研发上已经先行，同时，越来越多的企业进入到了mRNA的研发行列，并将mRNA技术应用到肿瘤疫苗、传染性疾病疫苗、CAR-T疗法、罕见病治疗、基因编辑等多个领域。

 

据不完全统计，主攻mRNA的企业有：斯微生物、蓝鹊生物、艾博生物、美诺恒康、深信生物、丽凡达、厚存纳米、瑞吉生物、嘉晨西海。对于mRNA产品的研发，中国军团也不落下风，且正有赶超之势。

 

总体来说，当前国内mRNA疫苗领域风向主要在于新冠mRNA疫苗项目的继续推进，更广泛的治疗领域布局，并在mRNA技术上不断寻求突破。同时，随着更多mRNA疫苗项目步入临床阶段，并逐渐实现商业化，大规模生产的需求上升。

 

mRNA疫苗开发面临的考验

mRNA疫苗开发过程可大致分为以下几个阶段，包括：靶点抗原的筛选与发现、mRNA的生产、mRNA纯化、mRNA递送、产品安全性和有效性分析方法建立等环节。

 

mRNA疫苗制备简单，但在开发上仍存在着一定的挑战。首先，mRNA的技术壁垒较高，短时间内还较难打破。虽然行业发展速度在加快，但是要形成一套完整成熟的mRNA成药体系，还是有许多需要突破，比如mRNA的序列优化、递送系统的改进，如何降低免疫原性等，这些都是挑战。

 

除此之外，目前的方案对于大规模生产来说还存在着一定考验。作为新兴技术，mRNA商业化生产、供应方面国内较为薄弱，针对核酸而设计的工具的使用较少。另外，mRNA领域在过去一年中出现了爆炸式增长，对原料的需求变得非常大。目前限制全球疫苗供应的最大瓶颈是原料的匮乏，包括mRNA合成中所需的酶以及递送系统中的关键物质——脂质纳米颗粒（LNP）都十分缺乏。

 

Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技）针对mRNA疫苗研发可提供从靶点筛选与发现，mRNA的生产、纯化、高效递送到分析方法建立的完整解决方案，帮助应对研发路径上的各项关键技术挑战，提升mRNA疫苗的有效性与安全性。

Thermo Fisher Scientific mRNA疫苗开发整体解决方案

 

mRNA体外合成优化策略

mRNA承担着将遗传信息传递为蛋白质的桥梁作用。mRNA疫苗中的mRNA进入人体细胞的细胞质后，mRNA被翻译，最终生产出对应蛋白质，从而激活免疫系统产生免疫反应、或对自身表达缺陷的蛋白质进行补充。

mRNA结构、递送和表达（图片来源：Biotechnology Advances）

 

mRNA的开发始于1990年，动物试验结果显示，将特定蛋白对应的mRNA注射到小鼠体内可检测到该蛋白的产生。但由于mRNA分子的不稳定性，注射入人体后尚未进入细胞就多被分解了，mRNA药物的开发陷入瓶颈，进展缓慢。而近年来，随着mRNA体外合成和递送技术的发展，mRNA的稳定性和翻译效率大幅提高。

 

体外合成过程包括模板线性化、体外转录、转录后修饰和模板降解四个环节。该过程优化的重要性主要体现在两方面：

 

• 对mRNA分子的修饰，影响着疫苗的稳定性、翻译效率、免疫原性。mRNA疫苗的开发始于对蛋白质结构和对应DNA片段的解析，从而获取翻译该蛋白质所需的mRNA分子。但仅根据DNA片段获取到的“初始”mRNA分子往往存在着稳定性不佳等问题，所以在此基础上对mRNA分子进行结构优化，对于最终获取安全、稳定、有效的mRNA疫苗十分重要。

 

• mRNA体外合成过程原料的优化，可有助于合成出纯度高、收率高的mRNA样品，大大缓解后续的纯化压力。mRNA疫苗效率的第一步保障仍然是对mRNA合成质量的严格把控。上游越完善，对下游施加的压力就越小。另外，选择可扩展且适合GMP制造的原料很重要，也将避免生产线上mRNA不合格导致资金浪费，以及生产进程延误等问题。

 

1)   模板线性化

 

mRNA合成过程从一个质粒DNA（pDNA）生成开始，该pDNA包含DNA依赖性RNA聚合酶启动子，如T7，和编码mRNA结构的相应序列。质粒在大肠杆菌的繁殖中得到扩增，然后从大肠杆菌中收获质粒。利用限制性内切酶把质粒切开，留下编码mRNA结构的DNA，制备并得到高纯的线性pDNA之后，制备mRNA的前序步骤就已经准备就绪了。

图片来源：nytimes.com

 

2)    体外转录

 

将上一步制备得到的线性化pDNA模板与重组RNA聚合酶（T7、T3 或 SP6）和三磷酸核苷（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶）等多种物质，在无细胞的反应器内混合，则可转录为mRNA。与用于制造其他路线的疫苗的耗时过程相比，该反应所需时间可能大大缩短。

 

图片来源：nytimes.com

 

高的mRNA产量需要高效的mRNA体外合成方法，大规模生产一般选择T7 RNA聚合酶体外转录。另外，在mRNA大规模合成过程中加入无机焦磷酸酶，可显著提高产量。

 

还有一种优化的策略是在mRNA合成阶段对核苷酸进行战略性替换。例如，胞嘧啶和尿嘧啶核苷酸可以分别替换为化学修饰的替代物，如5-甲基胞嘧啶或假尿嘧啶。这一策略可以减弱免疫反应，同时还能增强mRNA的稳定性和翻译效率。Moderna和BioNTech都利用了假尿嘧啶修饰对mRNA进行了优化。

 

3)   转录后修饰

 

通常，核酸酶会在几分钟内降解mRNA，而改变mRNA转录物的某些化学特征，则可以使其对核酸酶的吸引力降低。

 

调节3'端poly (A)尾部长度有助于mRNA的稳定性、运输和翻译，影响着mRNA的半衰期。另外，修改5' 端帽的化学结构也是有效的优化策略。用帽类似物加帽，例如m7GpppG帽类似物，是mRNA体外转录中最常见的方法，但研究发现一部分会以反向方式掺入mRNA中，从而不能被核糖体识别，导致翻译活性降低。而合成的抗反向帽类似物（ARCA）可以防止这种错误掺入，从而产生更稳定的mRNA，并提高翻译效率。

mRNA结构对关键质量属性的影响（npj Vaccines）

 

4)   模板降解

 

在mRNA合成结束后，使用DNA水解酶（DNase）将残留DNA模板去除，进入后续的mRNA纯化和制备步骤。

图片来源：nytimes.com

 

mRNA的体外合成过程，对于制备mRNA总工艺来说，极其重要。通过过程中酶的优化，可提高mRNA的产量、优化转录和成帽。同时，随着mRNA疗法的加速发展，常规科研级的体外转录试剂已不能满足需求，更多需要按照更高质量标准设计和生产的原料供应。

 

基于此，Thermo Fisher Scientific开发出了TheraPure产品线，为mRNA合成提供独特的完整解决方案，覆盖体外转录、转录后修饰及模板降解等流程。TheraPure mRNA合成试剂具有超高纯度，产品按照严格控制的纯度标准进行生产制造。生产过程中不含动物源成分（Animal origin-free, AOF）和抗生素（ampicillin-free，AF）,可最大限度减少对溯源性文件和责任追溯的需求。

TheraPure mRNA合成产品线

AOF和AF酶生产过程

如需了解更多TheraPure mRNA合成产品信息，请扫描访问以下二维码：

参考资料：

The promise of mRNAvaccines: a biotech and industrial perspective. doi:10.1038/s41541-020-0159-8

The challenge and prospect of mRNAtherapeutics landscape. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107534

mRNA vaccines manufacturing: Challenges andbottlenecks. doi:10.1016/j.vaccine.2021.03.038

Advances in the stability and delivery ofmRNA therapeutics, https://www.nature.com/articles/d42473-020-00426-z

Single-Use Based BioProduction Process forManufacturing of High Quality Recombinant Enzymes for mRNA and DNA Workflows https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/posters/single-use-bioproduction-manufacturing-recombinant-enzymes-mrna-dna-poster.pdf

How Pfizer Makes Its Covid-19 Vaccine https://www.nytimes.com/interactive/2021/health/pfizer-coronavirus-vaccine.html?searchResultPosition=2

识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！

请注明：姓名+研究方向！

版

权

声

明

本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。