Nature | “冤家”宜结不宜解！唐姗等报道在活体哺乳动物细胞中鉴定水解酶底物新方法

责编 | 兮

水解酶，包括蛋白酶，对于催化细胞中分子的合成和断裂至关重要。这些酶由人类基因组中2%到3%的基因编码，其中14%的酶是活性药物靶标【1】。尽管如此，许多水解酶的底物（冤家）和活性在很大程度上仍然未知。

2022年2月16日，来自英国剑桥分子生物学实验室（MRC-LMB）的Jason Chin团队在Nature杂志上发表了一篇题为Mechanism-based traps enable protease and hydrolase substrate discovery的文章 （唐姗博士为第一和共同通讯作者），报道了一种在活体哺乳动物细胞中的捕获和鉴定水解酶底物的新技术。

新方法建立在Jason Chin课题组之前的工作之上，即通过遗传密码扩展的技术将含胺类似物 2,3-二氨基丙酸 (Dap) 定点嵌入到水解酶的活性位点来代替水解酶的催化丝氨酸或半胱氨酸【2】。与正常的催化水解不同，含有Dap的水解酶与底物的反应停留在第一步，将底物片段共价连接到酶上。基于此，唐姗博士开发了一种新方法，直接在哺乳动物细胞中表达含有 Dap 前体的水解酶，通过光照激活其底物捕获功能，并表明被原位激活的含有Dap的水解酶可以在活细胞特异性地识别和捕获底物（图1）。

图1.使用 Dap 在细胞裂解液和活体哺乳动物细胞中共价“捕获”水解酶底物片段的新方法

通过与牛津大学威廉邓恩爵士病理学院的 Matthew Freeman课题组合作，作者们解决了鉴定膜内蛋白酶 (以RHBDL4为例) 底物这一挑战性难题（图2）。RHBDL4是哺乳动物细胞中唯一存在于内质网膜上的菱形蛋白水解酶，它利用其埋藏在磷脂双分子层中的丝氨酸来催化水解底物【3】。利用发展的新技术，作者们鉴定了RHBDL4在人源细胞中的底物，并确定了RHBDL4对一型跨膜蛋白的类sheddase的活性。更为令人惊讶的是，作者们首次揭示了RHBDL4 对在内质网保留的水溶性伴侣蛋白的特殊secretase的活性。与常规的secretase切割膜蛋白的跨膜域不同，RHBDL4通过移除内质网保留蛋白C-端的保留信号肽，促进了N-端结构域的分泌。

图2. 光激活的含Dap的膜内水解酶（黄色）捕获其底物（红色）（来源于MRC-Laboratory of Molecular Biology）

使用发展的新方法，作者们首次揭示了孤儿水解酶 RBBP9在人源细胞中的酶学活性。RBBP9含有α/β水解酶折叠域，但其在细胞中的酶学活性一直是个谜【4】。为了解决这一难题，唐姗博士与Adam Beattie发展了解析分叉多肽质谱的方法，直接鉴定了被含Dap的RBBP9捕获的分子基团，并证实了RBBP9在人源细胞中的氨基水解酶活性。不同于常见的金属氨基水解酶，RBBP9用丝氨酸催化水解，并选择性的去除N-端的芳香性氨基酸。

这项研究揭示了一种新的示例性策略，用于发现水解酶的新底物和活性。该研究具有临床意义，因为水解酶活性的异常调节是许多疾病的关键特征。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04414-9

制版人：十一

参考文献

[1] Klebe, G. in Drug Design: Methodology, Concepts, and Mode-of-Action (ed. Klebe, G.) 493–532 (Springer, 2013).

[2] Huguenin-Dezot, N. et al. Trapping biosynthetic acyl-enzyme intermediates with encoded 2,3-diaminopropionic acid. Nature 565, 112–117 (2019).

[3] Freeman, M. The rhomboid-like superfamily: molecular mechanisms and biological roles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 235–254 (2014).

[4] Vorobiev, S. M. et al. Crystal structure of human retinoblastoma binding protein 9. Proteins 74, 526-529, doi:10.1002/prot.22278 (2009).

转载须知

【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。