Cell | 转录因子蛋白相互作用组揭示先天性心脏病的遗传决定因素

撰文 | Qi

先天性心脏病（Congenital heart disease, CHD）存在于1%的活产婴儿中，但确定决定性的遗传因素仍具有挑战性。单基因从头突变导致了约10%的CHD病例，但仅基于这一因素就估算出超过390个基因可能有助于CHD的发病，这种异质性降低了CHD风险基因分析和当前可用队列的统计能力。此外，全外显子组测序需要大约10000名父母-先证者三人组来检测导致单倍体不足CHD的80%基因，强调了对替代策略的需求【1】。

许多疾病表现出组织受限的表型，但很少由组织特异性表达的基因突变引发。比如心脏畸形就与广泛表达的心脏转录因子（cTF）的突变相关。cTF错义突变能够破坏与其他特定蛋白的相互作用，影响它们的转录协调性影响发育基因程序【2】。GATA4和TBX5作为两个重要的cTF，是最早发现的家族性CHD的单基因病因之一。TBX5和GATA4在整个基因组的DNA上协同相互作用以调节心脏发育，错义突变破坏这些cTF之间或与其他特定辅助因子之间的物理相互作用从而损害转录协同性，并最终导致心脏畸形【2, 3】。因此，在心脏发生过程中鉴定人类GATA4和TBX5（GT）蛋白相互作用物有助于预测蛋白质编码变异对CHD的影响。

2022年2月18日，来自美国格莱斯顿研究所的Deepak Srivastava团队和Katherine S. Pollard团队在Cell杂志上合作发表了一篇题为Transcription factor protein interactomes reveal genetic determinants in heart disease 的文章，他们利用整合的蛋白组学和人类遗传学方法，剖析人类心脏祖细胞中内源性GATA4和TBX5的蛋白质-蛋白质相互作用物，识别携带CHD相关突变的潜在疾病基因，以揭示心脏基因调控的机制。

为了鉴定hiPSC衍生的心脏祖细胞（CPs）中的GATA4和TBX5蛋白相互作用组（GT-PPI），研究人员使用针对每种内源性cTF的抗体进行亲和纯化和质谱（AP-MS），并利用CRISPR-Cas9生成TBX5或GATA4纯和敲除的hiPSC作为对照，最终确认了272种候选蛋白。为了确认这些蛋白是否有助于预测CHD的遗传风险，作者将它们与先前报道的CHD相关数据进行比对，发现相互作用组种富含来自CHD先证者的从头突变（de novo variants, DNV）蛋白，其中包含20个遗传功能丧失（loss-of-function, LoF）DNV和53个错义DNV，前者多涉及影响心脏畸形的基因，而后者中的大部分先前并未报道与心脏发育或CHD相关。

图1. 对来自hiPSC衍生心脏祖细胞的GATA4和TBX5 进行AP-MS示意图

接下来，研究人员开发了一项为CHD trio全外显子测序数据集定制的工作流程，以计算这53个错义DNV的优先级分数，较高的分数能反映包括心脏高表达、与心脏畸形相关性高、突变对蛋白功能破坏性增加等特征。其中，GLYR1能通过核小体去甲基化参与染色质修饰和基因表达调控【4】，它的错义DNV为β-羟基酸脱氢酶结构域内的496位点高度保守的脯氨酸被亮氨酸所取代（P496L），该突变引起GLYR1该结构域的刚性增加，破坏与GATA4的物理相互作用。如果共表达野生型GLYR1和GATA4则能将Nppa-荧光素酶报告基因活性提高约15倍，若表达GLYR1突变体则能减弱活性。

为了研究GATA4-GLYR1在CPs中的共占性，研究人员在ChIP-seq后，将GLYR1在心脏祖细胞中募集的基因与在GLYR1所在基因窗口内与GATA4结合的基因进行比较，可以发现两者结合基因体的显着重叠，且与单独与两种基因分别结合的基因相比，重叠组中富集与心脏发育相关的GO term。为了直接评估GATA4和GLYR1是否调节它们共同占据的基因的转录，研究人员通过RNA-seq分析在分别沉默这两种基因后对心脏祖细胞中基因表达的影响，结果显示两者结合的基因在分别被siRNA敲低后显着下调约7倍。

接下来，研究人员利用CRISPR-Cas9构建包含纯和GLYR1 P496L和GLYR1 KO的hiPSC细胞系。与野生型细胞相比，GLYR1 KO引起多能性和细胞周期基因表达降低，肿瘤抑制基因和凋亡基因上调，而GLYR1 P496L中不存在上述变化。然而，在对GLYR1 P496L细胞进行心肌细胞的诱导分化过程中，P496L变体影响GLYR1的占有率和由GATA4共同结合的一组离散靶基因的转录调控，其中一些与人类心脏畸形和心肌病有关。

那么该突变是否会在体内对心脏造成损伤呢？为此，研究人员构建了一个含P495L（与人P496L同源）单倍体突变的小鼠，对出生一天的幼崽进行心脏组织学检查。其中，54%的Glyr1 ^P495L/P495L和15.5%的Glyr1 ^P495L/+小鼠在第0天和第1天之间表现出产后致死率，超声心动图和组织学分析显示15%的Glyr1 ^P495L/P495L小鼠存在室间隔缺损，为GLYR1在心脏发育中的生物学重要性提供了证据，并证明了P495L变体在体内的有害作用。此外，将Glyr1 ^P495L/+小鼠与GATA4突变小鼠杂交后，出生的88只幼崽中只有8只双杂合子，且5只在出生后24小时内死亡。组织学和超声心动图分析显示，所有双杂合子小鼠心脏均为畸形，心脏间隔缺损完全外显，其中约80%为房室间隔缺损。

总的来说，这项研究证实了GLYR1变体和GATA4-GLRY1相互作用在心脏发育中的重要性，通过组织和疾病特异性的蛋白间相互作用部分克服了CHD的遗传异质性，有助于了解疾病中从头错义突变的潜在影响。这种方法经过适当修改也可以用于了解其他遗传类疾病的遗传基础，

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.01.021

制版人：十一

参考文献

1. Sifrim, A., Hitz, M.-P., Wilsdon, A., Breckpot, J., Turki, S.H.A., Thienpont, B., McRae, J., Fitzgerald, T.W., Singh, T., Swaminathan, G.J., et al.; INTERVAL Study; UK10K Consortium; Deciphering Developmental Disorders Study (2016). Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nat. Genet. 48, 1060–1065.

2. Ang, Y.-S., Rivas, R.N., Ribeiro, A.J.S., Srivas, R., Rivera, J., Stone, N.R., Pratt, K., Mohamed, T.M.A., Fu, J.-D., Spencer, C.I., et al. (2016). Disease model of GATA4 mutation reveals transcription factor cooperativity in human cardiogenesis. Cell 167, 1734–1749.e22.

3. Garg, V., Kathiriya, I.S., Barnes, R., Schluterman, M.K., King, I.N., Butler, C.A., Rothrock, C.R., Eapen, R.S., Hirayama-Yamada, K., Joo, K., et al. (2003). GATA4 mutations cause human congenital heart defects and reveal an interaction with TBX5. Nature 424, 443–447.

4. Fang, R., Chen, F., Dong, Z., Hu, D., Barbera, A.J., Clark, E.A., Fang, J., Yang, Y., Mei, P., Rutenberg, M., et al. (2013). LSD2/KDM1B and its cofactor NPAC/ GLYR1 endow a structural and molecular model for regulation of H3K4 demethylation. Mol. Cell 49, 558–570.

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