Cell | 结核分歧杆菌药物靶点开发新方法

撰文 | 十一月

现有的抗菌剂一般以必需基因的产物为靶点，但很少能达到完全的靶点抑制效果。

2021年7月22日，美国洛克菲勒大学Jeremy M. Rock研究组与威尔康奈尔医学院Dirk Schnappinger研究组合作发文题为 Genome-wide gene expression tuning reveals diverse vulnerabilities of M. tuberculosis ，通过CRISPR干扰 （CRISPR interference） 这一全基因组基因表达分析方法 揭开了结核分歧杆菌的多种基因脆弱性 （Gene vulnerability） ， 为药物开发提供了新的靶点，同时该方法也发现了一些不易被破坏的必需基因，一定程度上解释了先前药物研发失败的原因。

药物靶点的开发依赖于对细菌核心生物学过程的破坏。研发过程中通常所采用的转座子插入测序 （Transposon insertion sequencing，TnSeq） 以及基因缺失的研究和开发方法 【1,2】 其实是将基因的必要性看做是一个二元选择题，认为一个基因对于细菌的适应性要么是必要的、要么是不必要的。但其实科学家们越来越多地意识到某些必须基因的作用并非非黑即白。基因表达与其适应性之间的关系被称为 基因脆弱性 【3】 。基因脆弱性将基因表达的抑制程度与生物体适应度的降低联系起来，从而将基因的重要性描述为一个连续变化的特性。了解基因脆弱性对于研究和靶向结核分枝杆菌 （Mycobacterium tuberculosis，Mtb） 具有重要意义。结核分枝杆菌是结核病的病原菌，是传染病导致死亡的主要原因之一，占与抗菌素耐药性有关的所有死亡的三分之一。

为了定量分析结核分枝杆菌的基因脆弱性，作者们开发了一个全基因尺度的CRISPR-Ca9干扰为基础的筛选平台 （图1） ，该平台能够系统性的调节超过两个数量级的内源性基因表达水平，并在变化的同时对结核分歧杆菌的适应度进行检测。为了建立基于CRISPRi的实验平台，作者们首先构建了一个靶向结核分歧杆菌所有注释过的基因的sgRNAs （single guide RNAs） 的文库 （图1） 。作者们主要通过两种方式来对Mtb的关键基因进行敲低，第一，通过Sth1dCas9识别非经典的PAM序列从而导致靶标基因的梯度敲低 【4】 ；第二，作者们通过改变sgRNA靶向序列的长度来调节sgRNA与DNA靶点之间的互补性，从而进一步影响靶点敲除效率 【5】 。最终作者们构建了一个由96,700个独特的sgRNAs和1,658个非靶向对照sgRNAs组成的文库，这些sgRNAs可以覆盖目前所有注释的Mtb基因中的98.2%。

在构建好相应的文库后，作者们建立了一个贝叶斯多级模型对靶点基因的敲低以及Mtb的适应度的关系模型，并提出基因脆弱性指数 （Vulnerability index，VI） 这一概念，对Mtb全基因的基因脆弱性进行指征 （图2） 。进一步地，作者们希望对预测数据对结核分歧杆菌及基因脆弱性预测结果进行评估，因此作者们转向了Msmeg数据库 【6】 。作者们发现本工作中建立的CRISPRi数据库所筛选到的基因脆弱性位点与Msmeg Tnseq数据库高度一致。在分析过Msmeg数据库后，作者们对6个关键基因与结核分歧杆菌的适应性之间的关系进行了进一步的验证。由此，作者们确认本研究中基于CRISPRi的方法来量化基因的脆弱性是非常准确的，这些关键基因的敲低幅度与菌株适应度息息相关。

图2 Mtb基因脆弱性遍布整个基因组

总的来说，作者们 开发的基于CRISPRi的实验方法可以对结核分歧杆菌的基因脆弱性进行量化，挑战了基因本质是一种非黑即白二元功能的一贯观点，从而将其描述为一个连续的变量。这些基因脆弱性的分布数据可以被用于对结核病靶点药物的开发。同时该工作也为不同结核分歧杆菌的生长以及脆弱性的扩大研究奠定了基础。另外，该方法也很容易推广到其他细菌性病原体的研究。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.06.033

制版人：十一

参考文献

1 Hawkins, J. S. et al. Mismatch-CRISPRi Reveals the Co-varying Expression-Fitness Relationships of Essential Genes in Escherichia coli and Bacillus subtilis. Cell systems 11, 523-535.e529, doi:10.1016/j.cels.2020.09.009 (2020).

2 Jost, M. et al. Titrating gene expression using libraries of systematically attenuated CRISPR guide RNAs. Nature biotechnology 38, 355-364, doi:10.1038/s41587-019-0387-5 (2020).

3 Barry, C. E., 3rd et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nature reviews. Microbiology 7, 845-855, doi:10.1038/nrmicro2236 (2009).

4 Rock, J. M. et al. Programmable transcriptional repression in mycobacteria using an orthogonal CRISPR interference platform. Nature microbiology 2, 16274, doi:10.1038/nmicrobiol.2016.274 (2017).

5 Qi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173-1183, doi:10.1016/j.cell.2013.02.022 (2013).

6 Dragset, M. S. et al. Genome-wide Phenotypic Profiling Identifies and Categorizes Genes Required for Mycobacterial Low Iron Fitness. Scientific reports 9, 11394, doi:10.1038/s41598-019-47905-y (2019).

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