点评 | 刘聪（中科院上海生物化学交叉中心）、冯银刚（中科院青岛生物能源与过程研究所）
人类文明的发展史就是一部与微生物相爱相杀的斗争史。从1928年开始，以盘尼西林（青霉素）为代表的一系列抗生素的陆续发现，使得很多由病原细菌引发的感染疾病得以成功治疗，人们曾不止一次认为看到了彻底战胜病原细菌的曙光 【1】。然而，几十年来，由于广谱抗生素、抗菌药物的大量使用或滥用，各种耐药性细菌或真菌大量涌现【2】，对全球公共卫生安全构成了巨大挑战。面对微生物的威胁，人类从未停止过斗争。揭示新的耐药机制、寻找新的抗菌靶点成为开发新型抗感染药物的迫切需求。
已有研究表明，80%的细菌感染与生物被膜的形成相关【3】。细菌生物被膜是细菌自身分泌的胞外基质相互粘连形成的，具有特定结构和功能的细胞群体。胞外基质的主要成分为胞外多糖、蛋白质、胞外DNA
(eDNA)
和脂质等【4】。生物被膜为细菌提供了机械屏障，可以抵御宿主免疫反应并导致细菌对抗生素及消毒剂的敏感性降低，从而增强它们在宿主和环境中的生存能力；此外，生物被膜内部是一种低氧、低pH、高二氧化碳且缺水的干燥环境，营养物质匮乏，不利于细菌生长代谢。传统抗生素可能由于生物被膜的屏障作用和生物被膜内细菌生长代谢改变导致其对成熟生物被膜内的细菌没有作用，生物被膜的形成因而与细菌的耐药性密切相关，也是造成慢性感染和病情迁延不愈的主要原因。
近年来，由多重耐药性金黄色葡萄球菌引起的院内感染已对全人类的健康构成极大威胁。全球每年有近100万人死于无法用传统抗生素治疗的细菌感染，其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌造成的死亡病例远超过由艾滋病和肺结核引起的死亡病例总和【5】。金黄色葡萄球菌的耐药性往往与其形成生物被膜密切相关。人们很早就在奶牛源金黄色葡萄球菌中发现一种被称作生物被膜相关蛋白
（Biofilm associated proteins）
的细胞表面蛋白Bap，Bap在介导葡萄球菌生物被膜的形成中发挥重要作用 【6】。Bap是一个多结构域蛋白，全长蛋白含有2276个氨基酸【6】。最近的研究表明，Bap蛋白的N末端在低pH和低钙下易于聚集形成功能性淀粉样纤维，并且促进细菌聚集和生物被膜的形成【7】。然而，Bap蛋白响应环境变化调控淀粉样纤维的形成以及介导生物被膜形成的机制并不清楚。
2021年5月28日，清华大学生命学院方显杨课题组在EMBO J杂志发表了题为
Structural mechanism for modulation of functional amyloid and biofilm formation by Staphylococcal Bap protein switch
的研究论文。该项工作解析了Bap蛋白N末端BSP结构域的1.9 Å的高分辨率晶体结构，该结构呈现哑铃形折叠，连接N末端和C末端的中间模块
（Middle module，MM）
由两个串联的全新的钙离子结合基序组成。尽管该基序曾被预测为可结合钙离子的EF-hand，晶体结构表明，不同于传统的EF-hand形成Helix-Loop-Helix的结构并仅结合一个钙离子，该基序形成了Loop-Helix-Loop的结构而且结合两个钙离子，因而是一种全新的钙离子结合基序。小角X射线散射
（SAXS）
，核磁共振
（NMR）
和分子动力学模拟数据表明，中间模块响应钙离子浓度变化发生从有序到无序的构象转换。体外和体内的生化实验表明，BSP的N端在酸性
（pH <= 4.5）
条件下通过液相-液相和液相-固相相变形成淀粉样纤维并介导生物被膜形成。该过程受到低钙离子条件下处于无序构象的中间模块
（MM）
的促进，而钙离子结合可促进中间模块的紧凑折叠，并与周边模块形成相互作用网络，从而抑制相分离发生以及生物被膜的形成。由于许多细菌都通过Bap形成生物被膜，对Bap蛋白介导金黄色葡萄球菌生物被膜形成的调控机制的揭示，有助于开展相关的药物设计。
图1. Bap形成淀粉样纤维及介导金黄色葡萄球菌形成生物被膜的调控机制
1. BSP的N末端包含重复串联的结构模块，可作为支架蛋白介导液液相分离，并通过液固相变聚集为淀粉样纤维。这是迄今为止发现的第一个可经由相分离形成功能性淀粉样纤维的细菌细胞表面蛋白，表明相分离过程在细菌功能性淀粉样纤维的形成过程中发挥重要作用。
2. BSP的中间模块作为一种新颖的钙离子结合基序，其结构与近年来在真核和原核生物中发现的多种钙离子结合基序完全不同。中间模块通过感应钙离子和pH的变化而发生“无序↔有序”之间的构象转变，赋予细菌响应外界环境信号并在特殊条件下生存的能力。
3. 在低pH和低钙离子浓度条件下，BSP的各结构模块协同性的调控淀粉样纤维的形成进而介导金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。
清华大学生命学院方显杨助理教授为文章的通讯作者, 2016级博士研究生
马俊锋
是文章的第一作者，研究助理
程翔
，2017级博士研究生
徐钟河
，已毕业博士生
张一堪
对该课题做出了重要贡献。
https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2020107500
蛋白淀粉样聚集体最早被发现与多种人类重要的神经退行性疾病
（如阿尔兹海默病，帕金森病等）
的发生与发展密切相关，因此，早期研究认为蛋白淀粉样聚集普遍具有病理毒性。近年来，越来越多的研究表明，来自人，细菌及其他物种的不同蛋白可以通过以液-固相转化形成淀粉样纤维聚集体的形式执行不同的正常生理功能，例如：酵母细胞中的Sup35蛋白, 人源细胞中的RIPK3等。在不同类型的细菌中，存在一类生物被膜相关蛋白能够形成功能性淀粉样纤维，并进一步聚集形成生物被膜
（biofilm）
。生物被膜在细菌的表面粘附及抵御环境胁迫等方面起到至关重要的作用。因此，研究功能性淀粉样纤维的动态组装及调控机制对于理解细菌生物被膜的形成以及抗菌药物的研发具有重要的理论及实际意义。然而，相比于病理性蛋白淀粉样纤维，针对功能性蛋白淀粉样的研究还相对滞后。
近期，清华大学的方显杨课题组报道了来源于奶牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜相关蛋白Bap动态组装形成功能性淀粉样聚集的分子机制。本项研究工作发现Bap在酸性或低钙离子条件下自发通过液-液相分离形成动态蛋白凝聚体，进一步通过液-固相转化组装形成功能性淀粉样纤维聚集体。暗示蛋白质液-液相分离可作为一个动态调控功能性蛋白纤维化的重要中间步骤。研究人员进一步整合多种不同结构生物学及计算生物学方式，阐释了Bap通过pH以及钙离子诱导产生的构象变化引起液-液相分离以及液-固相转化的结构基础。本工作对于理解外在环境因素如何诱导蛋白相分离以及淀粉样纤维的形成具有重要的意义。此外，本研究为设计和发展调控Bap相分离及相变小分子抑制剂提供了新的思路。
值得指出的是，本研究在Bap的天然构象
（非聚集态）
研究上取得了重要的发现，但同时也留下了很多有意思的问题。例如：Bap在液-液相分离条件下以及进一步组装形成功能性淀粉样纤维中的构象是什么？其如何从天然构象转化而来？Bap在功能性淀粉样纤维的构象是如何决定其功能的？这些关键科学问题对于理解蛋白相变与相分离的结构基础以及功能性淀粉样纤维与病理性淀粉样纤维的区别都具有较为重要的意义，期待接下来的研究能够进一步解答。
细菌生物被膜是在特殊条件下由细菌分泌的多糖蛋白复合物，通常包裹在细菌表面并附着于某种实体表面。形成生物被膜的细菌具有很强的对抗恶劣环境的能力，同时也是许多病原菌在体内难以被根治的原因之一，因此生物被膜的研究不仅对于理解微生物与环境的互作具有重要意义，而且在抗菌药物的开发中也有重要的价值。清华大学方显杨课题组最近在EMBO Journal上发表的一项研究工作通过对金黄色葡萄球菌的生物被膜相关蛋白
（Bap）
的易聚合区域的结构和生物物理研究，揭示了一个新型钙结合模块在pH和钙离子调控的淀粉样聚合、液液相分离和生物被膜形成中的关键作用，从而提出了一种全新的生物被膜形成调控的结构分子机制。
方显杨课题组的这一工作，除了在生物被膜的研究中具有重要的意义，在研究方法和思路上也非常具有特色。这一工作从Bap的易聚合区域的晶体结构解析出发，使用了一系列的生物物理手段逐步阐明了这一区的生理功能和分子机制。在这一系列实验中，Bap易聚合区域的晶体结构提供了高分辨的结构模型，发现了新型的双钙离子结合模块；通过小角X射线散射
（SAXS）
和核磁共振
（NMR）
方法，揭示了溶液状态下钙离子依赖的构象变化；通过透射电镜和ThT荧光监测，测定了pH和钙离子依赖的淀粉样纤维形成；通过融合GFP进行荧光显微镜观测，确定了决定pH和钙离子调控的液液相分离过程的关键区域；最后通过在Bap敲除菌中回补缺失部分区域的突变体，测定细菌生物被膜的表型验证了各个区域在生物被膜形成中的关键作用。这一系列实验从结构到功能逐步深入，充分展示了各种技术的优势，读来让人感到如庖丁解牛般十分舒畅。
到目前为止，X射线晶体学仍然是获得高分辨蛋白质结构的首选技术；SAXS和NMR是研究在溶液状态下蛋白质构象变化过程的最理想手段，且具有互补性：SAXS更能反映全局性结构变化而NMR则可以反映到原子水平的结构变化；透射电镜则是观察淀粉样纤维等超分子形态的理想技术；荧光技术在研究蛋白质相变过程和区室化定位中非常有效。所有这些生物物理技术可以从深入到原子的层次揭示蛋白质的功能机制，而这些体外实验所揭示的功能机制需要通过体内实验进一步验证，从而使我们对重要的生理过程的分子机制得到极其深入的理解。方显杨课题组在EMBO Journal上发表的这一工作为蛋白质的结构功能研究提供了极好的范例。
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