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微管细胞骨架是真核细胞的关键结构和动力学组成部分。微管组装成各种各样的动态阵列和结构，参与多种细胞功能，例如细胞分裂、运动、形状和细胞内运输等。组成微管的蛋白质称为微管蛋白，除微管蛋白外，细胞内还存在其他蛋白质与微管结合，这些蛋白质统称为微管相关蛋白（microtubule-associated proteins，MAPs)，包括分子马达蛋白【1】、切割微管正负极的酶【2】和蛋白质【3】。MAPs可增加微管的稳定性，促进微管的组装，并调节微管与其他细胞成分之间的关系，是维持微管结构和功能必需的成分。因此，了解MAPs如何控制微管的性质和功能对于破译微管细胞骨架的工作至关重要。目前微管研究的金标准（gold standard）是通过纯化微管相关功能组分进行体外重建分析【4】，但该方法很大程度上依赖于功能组分的成功纯化，而这往往也是一个主要的研究障碍。新发现的MAPs不断增加【5】，MAP与人类疾病之间的联系越来越多，但大多数MAPs的特征仍然很不明确，进而阻碍了我们对其生物学作用的理解。那么是否可以建立一种能够在无细胞环境下更快、更少限制地描述microtubule-MAP组装的方法呢？
近期，来自法国巴黎文理研究大学的Carsten Janke 团队在Nature Cell Biology杂志上在线发表了题为Lysate-based pipeline to characterize microtubule-associated proteins uncovers unique microtubule behaviours 的研究论文，报道了一种表征微管相关蛋白、探究微管行为的新方法——在无细胞条件下使用哺乳动物细胞裂解液对MAPs进行中等通量分析（定量和超微结构分析），进而描述MAPs如何控制微管特性和功能。该方法可以全面地表征MAPs和MAPs突变体，为确定其生理作用和病理含义的机制开辟了新道路。
利用lysate-based pipeline研究MAPs的主要流程如图1所示：Step1-为了能够分析任何候选MAPs，采用快速、简单的不依赖序列和连接的克隆方法（simple sequence- and ligation-independent cloning, SLIC）【6】从头克隆感兴趣的蛋白质的开放阅读框，并给所有候选MAPs的羧基末端加上GFP；Step2-在U-2 OS细胞中检测荧光标记蛋白的表达，验证蛋白的胞内定位；Step3-在HEK293细胞中表达GFP-tagged MAPs，从而制备含有过表达荧光标记蛋白的可溶性细胞质裂解液, 用于后续的cell-free分析（通过控制所有裂解液中的总蛋白浓度，确保在所有实验中内源性微管蛋白的浓度相似，使GFP-tagged MAP成为唯一的可变成分）；Step4-将细胞裂解液直接引入流动室（flow chambers），通过TIRF显微镜记录GFP-MAPs，观察MAPs对微管动态的影响。作者通过分析功能已知的MAPs（microtubule-servering enzyme spastin和end-binding protein 3 (EB3)）对该系统进行验证。结果显示，将微管与含有spastin的细胞裂解液共同孵育时，可以观察到微管的有效切割；将微管与含有EB3的细胞裂解液共同孵育时，EB3也可以示踪微管的（+）端。这些数据表明基于裂解液的方法可以重现之前基于细胞或体外重建实验中所知的微管-MAP相互作用，证实了该方法的可靠性。
图1. 利用lysate-based pipeline表征MAPs的实验流程示意图
随后，作者采用lysate-based pipeline对45个候选MAPs的功能进行了系统性的表征。通过在U-2 OS细胞中过表达这45个MAPs，作者观察到MAPs的3种主要行为特征（图2）：（1）强烈捆绑（结合）微管（Strong MT bundling）；（2）装饰微管和诱导少量可见的微管束（Weak or no MT bundling）；（3）完全不结合微管（No MT bundling）。接下来，作者在HEK293中过表达45个MAPs后制备了细胞裂解液，分析它们对微管生长过程的影响。其中40个MAPs在裂解液中与生长中的微管共定位，大多数的MAPs可以不依赖微管seeds诱导微管聚合。通过进一步分析MAPs与F-actin的关系，作者将45个候选MAPs归为3类：（1）与微管结合但不与F-actin align的MAPs；（2）与微管结合并促进F-actin与微管协同排列的MAPs;（3）不与微管结合的蛋白。细胞内MAPs行为和基于裂解液的实验显示，大多数与细胞内微管相关的MAP也会促进裂解液中微管的聚合和生长，表明lysate-based pipeline是一个强大和通用的工具，可用于分析MAPs在无细胞条件下对微管生长的影响。
图2. 候选MAPs在U-2 OS细胞中表现出的三种主要行为
之前对MAP家族成员功能的研究通常都是相对独立的，而lysate-based pipeline可以实现家族成员之间的并行性分析。通过比较mammalian echinoderm MAP-like（EML）蛋白家族成员，作者发现它们在行为上有显著差异：虽然EML1、3和4与生长中的微管相互作用，但在EML2存在的情况下没有观察到微管聚合，这与之前的研究结论一致，即EML2具有微管解聚活性【7】。尽管EML家族成员的序列相似，但每种EML蛋白都具有不同类型的微管相互作用。随后作者还对MAP7家族进行了探究。MAP7家族包含4个不同的蛋白：MAP7，MAP7D1，MAP7D2和MAP7D3，体外研究表明，它们不同程度地参与驱动蛋白与微管的连接【8】。在lysate-based pipeline中，MAP7，而不是MAP7家族的其他成员，诱导了典型的星形（aster）微管阵列的形成，这些发现可能为MAP7诱导的微管aster的形成提供一个更深入的机制表征框架。
通过lysate-based pipeline方法，作者还观察到了部分MAP诱导的独特的微管行为（图3）：Centriole, cilia and spindle-associated protein（CSAP）最早被报道为与中心粒、有丝分裂纺锤体和纤毛上的多聚谷氨酰胺化微管特异性共定位的MAP【9】，后来又被报道为微管聚谷氨酰胺化酶的招募因子【10】，而CSAP在裂解液中可以诱导微管螺旋（helics）的形成；微管-肌动蛋白交联剂MACF1，在裂解液中装饰生长中微管的晶格，在微管的生长端自发形成钩子（hooks），进而阻止微管的进一步延伸；神经元MAP MAP2在神经元中可表达较小异构体 MAP2C（~51 kDa）和MAP2D（~54 kDa），二者在裂解液中都能强烈促进微管聚合，同时还具有微弱的钩状结构的诱导能力（以前未知）；最后，作者观察到裂解液中的微管可以产生滑动活动。
图3. MAPs在裂解物中诱导产生独特微管行为
MAP控制微管组装和动力学的能力，以及它们诱导特定微管阵列形成的能力是浓度依赖性的【11】。为了确定裂解液中MAP浓度的影响，作者分析了MACF1 (C1023)（a truncated version of MACF1 encoding the carboxy-terminal 1,023 amino acids）诱导微管钩形成的过程。结果显示，在含有520nM MACF1(C1023)-GFP的裂解液中，微管的生长由于钩的形成而迅速停止；而在260nM时，微管在钩形成之前可以更稳定地生长；130nM处形成钩状微管的数量明显减少；含有65nM MACF1(C1023) GFP的裂解液中，完全没有形成钩状微管。这些数据表明，在细胞中，微管钩可能是由MACF1的局部积累诱导的。
通过对遗传性疾病患者进行全基因组或外显子组测序，发现了大量与人类疾病谱系相关的MAP突变，能够快速和可靠地测试这些突变对MAP功能的影响，对于理解这些疾病的分子机制至关重要。为了测试lysate-based方法是否可以用于MAP突变体的功能表征，作者分析了来自皮质下异位（一种导致大脑畸形的神经发育障碍）患者的EML1突变EML1 (T243A)。作者发现，与野生型EML1相比较，EML1 T243A的微管结合能力明显下降，因此可能影响携带该突变患者神经元中微管细胞骨架的整体动力学和结构。Lysate-based方法还可以揭示突变的间接影响，如导致MAP的隔离，或者MAP在与另一种可能存在于细胞裂解液中的微管结合物共享位点的结合上变得不那么具有竞争性（这些间接效应在纯化组分的体外结合实验中是检测不到的）。这些数据使lysate-based pipeline成为一种有希望的工具，用于疾病相关MAP突变的中大规模分析。
最后，作者发现细胞裂解液也可以直接用于cryo-electron microscopy的超微结构研究。在结构水平上理解微管MAP相互作用的最大挑战之一是，许多MAP本质上是非结构蛋白（intrinsically unstructured proteins）。采用lysate-based pipeline方法可获得高分辨率的MAP与微管结合的电子密度图，可以用于重建高分辨率结构，揭示MAP与微管的结合模式。
综上所述，该研究建立并验证了细胞裂解液中细胞骨架组装的重构分析，作为一种快速、直接和中等通量的方法，以单微管分辨率来表征微管-MAP组装。与传统的体外重建分析相比较，该方法具有以下优势：（1）使用哺乳动物细胞过表达荧光标记蛋白的裂解液可以绕过体外重组实验的一个关键瓶颈——新蛋白的纯化；（2）微管聚合所需的所有成分，即游离微管蛋白和GTP直接来自细胞裂解液，使得该方法具有高度的可重复性，并且不受其他因素的影响；（3）具有发现MAP未知活性的能力；（4）具有可重复性定量测量和超微结构分析的适用性，以及表征疾病相关突变的能力。
原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41556-021-00825-4
参考文献
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