​Sci Adv | 孟安明课题组揭示tRNA衍生小RNA调控胚胎早期发育的机制

tRNA作为看家基因，其为人熟知的主要功能是携带特定的氨基酸并将其转运至核糖体，促使新生肽链的顺利合成。随着测序技术的发展，研究人员发现tRNA可以被进一步剪切加工，以更短的形式存在——tRNA衍生小RNA片段 （tRNA-derived Fragments，tRF） 。成熟的tRNA具有三叶草型二级结构，核酸酶在不同的位置切割会产生不同长度和来源的RNA。早期，研究者发现部分细胞在经受渗透压改变、辐照等刺激时，会产生一系列tRNA衍生小RNA，参与应激颗粒 （Stress Granule） 的形成，并调控蛋白质翻译 【1】 。其后，系列研究表明小鼠精子中富含tRNA衍生小RNA，这些小RNA可以通过跨代遗传进而影响下一代的生理指标，但其在小鼠早期胚胎发育中的功能并不清楚【2, 3】。

2021年11月19日，清华大学生命学院的孟安明教授课题组在杂志Science Advances在线发表了题为  5’Half of specific tRNAs feeds back to promote corresponding tRNA gene transcription in vertebrate embryos 的研究论文。该研究论文 首次报道了来源于tRNA^Glu/CTC和tRNA^Gly/GCC的5‘端衍生小RNA(5‘tRNA-Fragment long, 5’tRFl)在斑马鱼胚胎发育早期调控tRNA转录的机制。 敲低胚胎中5’tRFl^Glu/CTC和5’tRFl^GlyGCC，将导致相应的tRNA水平降低，翻译效率下降，最终胚胎发育停滞。本研究发现，这两种5‘tRFl通过与tRNA竞争结合tDNA模板链形成R-loop结构，从而促进tRNA的转录，维持了早期胚胎发育的正常进行。

研究首先通过小RNA测序，检测了斑马鱼早期胚胎不同时期小RNA的表达情况。研究者引入了T4 PNK和ALBK去甲基化酶对RNA进行了预处理，以克服修饰末端对tRNA衍生小RNA建库造成的偏差。测序结果表明，早期胚胎中tRNA衍生小RNA含量大约在5~9%，其中在单细胞期和256细胞期较低，其后占比慢慢增加。5‘tRFl是最主要的类型，占比约80%，其中5‘tRFl^Gly/GCC和5’tRFl^Glu/CTC的含量相对较高，并且表达水平呈现出伴随胚胎早期发育的进行逐步增加的趋势，这与其相应全长tRNA的表达趋势相同。

为研究5‘tRFl^Gly/GCC和5’tRFl^Glu/CTC在胚胎发育过程中的功能，研究者设计了互补的吗啉环修饰的反义寡核苷酸链 （Morpholino，MO） ，在单细胞期注射，通过结合抑制5’tRFl的功能。观察发现，敲低5‘tRFl^Gly/GCC或5’tRFl^Glu/CTC都会导致胚胎出现发育停滞并凋亡的现象，同时胚胎的整体蛋白翻译效率也出现明显下降。因5’tRFl与tRNA具有相似的表达趋势，研究者通过Northern Blot和RT-qPCR等实验手段发现，相应的全长tRNA水平在敲低5’tRFl后也出现了明显下降：在5‘tRFl^Gly/GCC敲低的胚胎中，全长tRNA^Gly/GCC的水平在Sphere时期下降了约60%，而tRNA^Glu/CTC的水平维持稳定；在5‘tRFl^Glu/CTC敲低的胚胎中，全长tRNA^Glu/CTC的水平在Shield时期下降了约80%，相反，tRNA^Gly/GCC水平维持恒定。注射纯化的酵母tRNA^Gly/GCC或斑马鱼内源tRNA^Glu/CTC能显著挽救相应5’tRFl敲低导致的发育停滞表型，表明5’tRFl功能缺失使tRNA水平下降是表型发生的主要原因。此外，注射5’tRFl的类似物，也在一定程度上能提高相应tRNA的水平。通过抗体特异识别RNA聚合酶III的染色体结合区域，发现tDNA^Glu/CTC的不同位点上，聚合酶的结合频率在敲低5’tRFl^Glu/CTC后显著下降。综上结果表明，5‘tRFl对tRNA水平的调控是转录水平上的，而这一点也在真核体外转录系统中得到了验证。

有文献报道，tRNA的转录可能受到tDNA上R-loop结构 （RNA与DNA形成的杂交链与另一条DNA单链共同构成的结构） 的抑制【4】。研究者通过ssDRIP-seq这一技术【5】，检测了早期三个时期的胚胎基因组上R-loop的分布和变化，发现256细胞期tDNA的模板链上具有明显的R-loop结构，而R-loop水平会伴随发育逐步下降，这与全长tRNA和5‘tRFl的表达呈相反的变化趋势。进一步通过分离基因组上R-loop中的RNA链，发现全长tRNA和5’tRFl均能和基因组结合形成RNA:DNA杂交链。敲低5’tRFl会导致基因组上结合的全长tRNA含量增高和不同tDNA位点上R-loop水平的增加。同时，胚胎内过表达RNaseH，一种特异靶向RNA:DNA双链的RNA酶，则能显著增加tRNA的表达水平。说明tDNA模板链上所形成的R-loop会抑制tRNA的转录效率。R-loop的稳定性与结合RNA的长度呈正相关，全长tRNA在tDNA模板链上形成的R-loop具有显著高于5’tRFl形成的R-loop的稳定性。tRNA与其5‘tRFl具有相同的序列，会竞争性的结合相应的DNA序列，那么较为不稳定的5’tRFl:DNA这个双链结构的存在则明显能抑制更稳定的tRNA:DNA的形成，从而维持了RNA聚合酶在tDNA模板上的转录效率。

tRNA衍生小RNA因其长度和序列的多样性，关于这类RNA的功能目前尚无定论。本研究通过实验验证，提出了tRNA衍生小RNA调控转录的一种新的机制，并探究了其在脊椎动物胚胎早期发育中的调控方式。而这种调控方式是tRNA特有的，还是一种广泛的现象，很值得进一步探索。

本研究通讯作者为清华大学生命学院孟安明教授，第一作者为陈露西博士。原清华大学生命学院孙前文教授课题组的徐炜博士和刘坤朋博士参与了本文ssDRIP-seq等相关内容的研究。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abh0494

制版人：十一

参考文献

1. Su Z, Wilson B, Kumar P, Dutta A. Noncanonical Roles of tRNAs: tRNA Fragments and Beyond. Annu Rev Genet. 2020 Nov 23;54:47-69. doi: 10.1146/annurev-genet-022620-101840.

2. Sharma U, Conine CC, Shea JM, Boskovic A, Derr AG, Bing XY, Belleannee C, Kucukural A, Serra RW, Sun F, Song L, Carone BR, Ricci EP, Li XZ, Fauquier L, Moore MJ, Sullivan R, Mello CC, Garber M, Rando OJ. Biogenesis and function of tRNA fragments during sperm maturation and fertilization in mammals. Science. 2016 Jan 22;351(6271):391-396. doi: 10.1126/science.aad6780.

3. Chen Q, Yan M, Cao Z, Li X, Zhang Y, Shi J, Feng GH, Peng H, Zhang X, Zhang Y, Qian J, Duan E, Zhai Q, Zhou Q. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 2016 Jan 22;351(6271):397-400. doi: 10.1126/science.aad7977.

4. El Hage A, Webb S, Kerr A, Tollervey D (2014) Genome-Wide Distribution of RNA-DNA Hybrids Identifies RNase H Targets in tRNA Genes, Retrotransposons and Mitochondria. PLOS Genetics 10(10): e1004716. doi: 10.1371/journal.pgen.1004716

5. Xu W, Xu H, Li K, Fan Y, Liu Y, Yang X, Sun Q. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nat Plants. 2017 Sep;3(9):704-714. doi: 10.1038/s41477-017-0004-x. Epub 2017 Aug 28. PMID: 28848233.

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