2021年3月25日，清华大学丁强团队在PLoS pathogens上发表了题为“Comparative analysis reveals the species-specific genetic determinants of ACE2  required for SARS-CoV-2 entry”的研究论文,该研究基于考拉、小鼠ACE2序列与人ACE2序列的比较结果，通过遗传和功能分析，发现了决定考拉和小鼠ACE2不能有效结合SARS-CoV-2 S蛋白使其进入宿主细胞的关键位点。

研究者为了确定限制考拉和小鼠ACE2病毒受体活性的遗传决定因素，基于ACE2-S蛋白复合物的结构图，通过分析不同ACE2直系同源物种S蛋白的RBD表面氨基酸残基，发现很多氨基酸残基通过互相形成氢键或π-π键来维持复合物结构，例如ACE2的K31和K353与RBD的Q493和G502的羧基氧形成氢键，从而提供大量的能量来稳定ACE2-S蛋白复合物，但是考拉（T31 和F83）及小鼠（F83和 H353）相应的关键氨基酸残基与其他物种存在差异，可能导致病毒无法进入其体内。

▲ ACE2中的潜在残基限制了SARS-CoV-2的进入

为了直接揭示考拉和小鼠ACE2中这些不同的残基对病毒进入的影响，研究者观察了带有人源化氨基酸残基的突变小鼠和考拉结合S蛋白及介导病毒的能力：将Fc和SARS-CoV-2的S1融合蛋白与过表达带有绿色荧光报告基因的不同物种ACE2的A549细胞共孵育，通过流式细胞术检测绿色荧光中S1蛋白阳性的百分比，来评估结合能力。

结果显示，S1-Fc与表达小鼠或考拉ACE2的A549细胞的结合非常低，与空载体转导的细胞中观察到的水平相当，而S1-Fc蛋白与表达人ACE2的A549细胞有效。结合人与小鼠hACE2 Y83F / K353H双突变体显著降低了结合率（49.9％vs 98.1％）， 人与考拉的单个hACE2 K31T突变体具有显著受损的结合（52.8％vs 98.1％），随着残基353突变（K31T / K353H；28.6％vs 98.1％）而进一步降低，表明K31对ACE2与S蛋白相互作用至关重要；而双重人源化小鼠（mACE2 F83Y / H353）和考拉（kACE2 T31K / F83Y）突变体表现出更高的结合效率（83.9％和92.1％），尽管F83Y突变本身对小鼠或考拉ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白的结合影响极小，但分别将此突变与H353K或T31K结合具有协同作用，以上结果表明小鼠ACE2中的残基353和考拉ACE2中的残基31是这两个直系同源物结合S蛋白的物种特异性限制的遗传基础。

为了确定这些研究结果是否仅适用于SARS-CoV-2 S蛋白，研究者还评估了这些突变体结合SARS-CoV S蛋白的能力。与SARS-CoV-2 S蛋白相反，小鼠ACE2可以结合SARS-CoV S蛋白（40.4％vs 0.8％）。小鼠ACE2中的单突变或双突变（F83Y，H353K或F83Y / H353K）进一步提高了结合效率（分别为63.7％，83.1％或81.8％），有时甚至超过了人类ACE2的结合效率（64.0％）。有趣的是，与SARS-CoV-2 S蛋白不同，野生型或人源化考拉ACE2与SARS-CoV S蛋白的结合能力都非常弱。这些表明，尽管SARS-CoV和SARS-CoV-2都以人ACE2作为进入细胞的受体，但是受体相互作用和识别在功能上存在重要的差异，这可能会导致这两个病毒之间的宿主范围，组织嗜性和致病性存在差异。

▲ SARS-CoV-2进入所需的ACE2基因决定因子

▲ ACE2突变体结合病毒刺突蛋白

接下来，为了进一步明确ACE2变体的异位表达具有功能性，且可以促进表达S蛋白的MLV逆转录病毒颗粒（以Fluc为报告基因）进入A549细胞，研究者通过用不同的假病毒颗粒接种表达ACE2变体的A549细胞并进行孵育后，裂解细胞并测定萤光素酶活性以确定假病毒颗粒是否成功进入。结果表明，与野生型同源基因相比，小鼠和考拉F83Y ACE2变体均未显着增加病毒进入。相反，mACE2 H353K和kACE2 T31K各自显著增强了病毒的进入现象，并且在双重人源化突变体中有明显的协同作用，通过改变一个或两个氨基酸使小鼠或考拉ACE2人源化导致介导SARS-CoV-2进入的能力。

与此同时，研究者还发现小鼠ACE2可以与SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白结合，并分别介导假颗粒的进入，但不与考拉结合。相比之下，人源化的考拉ACE2只能结合SARs-CoV-2的S蛋白，并仅介导表达该蛋白的假病毒颗粒的进入。这些观察结果突显了SARS-CoV和SARS-CoV-2通过ACE2进入所使用的不同机制。

综上所述，该研究为SARS-CoV-2与细胞受体ACE2之间相互作用的物种特异性提供了更多信息，确定了SARS-CoV-2宿主范围的遗传基础，为SARS-CoV-2研究开发新的动物模型奠定基础。