Molecular Cell︱分子伴侣热休克蛋白解聚系统的内源性新机制

撰文 | 咸姐

在所有的细胞生命中，温度的突然升高——热休克——会导致细胞内聚集体的形成和热休克蛋白的产生，其中许多蛋白起着分子伴侣的作用。体外实验证实，包含分子伴侣Hsp100、Hsp70和Hsp40的分子解聚系统可以使得模型底物的聚集体（如热错折叠的萤火虫荧光素酶）分解而恢复其功能【1】，从而也支持了长期以来的观点，即分子伴侣的产生是为了保护细胞免受应激诱导的错误折叠蛋白质及其受损聚集体的毒性影响。

就现阶段的研究而言，热诱导的错误折叠成熟蛋白质聚集体被认为是解聚系统的主要底物。然而，目前还没有发现真核生物内源性成熟蛋白在对生理性热休克（即细胞已适应的自然环境中遇到的非致死性高温波动）作出反应时发生错误折叠。因此，不得不承认的是，在我们对热休克反应的理解中，分子伴侣直接参与并分解热休克诱导的内源性聚集体这一核心因素尚未得到验证。

最近的研究表明，蛋白质毒性模型，以及生理性热休克引起广泛的蛋白质错误折叠的观点必须得到扩展。一项针对出芽酵母的蛋白质组研究发现，一组特定的成熟蛋白质在热休克时可以形成完全可逆的凝聚物【2】，仔细观察发现，这种明显聚集的几种情况反映了进化的适应性生物分子凝聚。例如，生理性热休克温度和pH变化会导致poly(A)结合蛋白（Pab1，一种丰富而广泛的真核生物保守的RNA结合蛋白）在体外进行相分离并形成凝胶状凝聚物，抑制Pab1的凝聚可降低细胞在长时间热应激下的适应性，表明该凝聚是有适应能力的【3】。近年来陆续有研究人员推测，热诱导的生物分子“凝聚物”（本文中采用此术语指代聚集的生物分子的内源性假定适应性无膜结构，不考虑凝聚机制）是分子伴侣的主要内源性底物，然而，热休克蛋白是否直接参与热诱导的凝聚物、适应性凝聚物和模型错误折叠底物的“聚集体”（本文中采用此术语指代错误折叠的蛋白质的无定形团块，通常对细胞有害）之间的功能参与是否不同、如何不同，这些问题仍然没有确切的答案。

近日，来自美国芝加哥大学的D. Allan Drummond团队在Molecular Cell在线发表题为 Chaperones directly and efficiently disperse stress-triggered biomolecular condensates 的文章，发现与模型错误折叠蛋白的“聚集体”相比，解聚系统（分子伴侣Hsp100/Hsp70/Hsp40）能够直接且更有效地分解热诱导的内源性生物分子“凝聚物”，并且两者具有不同的分子依赖性，从而为长期研究的热休克蛋白建立了一个可靠的内源性热诱导底物，从生物化学角度表明，伴侣蛋白除了清理应激诱导的蛋白毒性“聚集体”外，还可调节应激诱导的适应性“凝聚物”。

与早些的研究结果一致，本文研究人员首先证实了在42℃热休克条件下，Pab1在体内能够迅速形成稳定的抗核糖核酸酶凝聚物，而随着细胞从应激中恢复，成熟内源性蛋白质的凝聚物可在一小时内分解成其应激前的可溶形式，而不会降解。随后，研究人员将纯化的Pab1在pH值为6.8的环境下于42℃处理20 min以在体外重组Pab1凝聚物，然后利用尺寸排除色谱法（SEC）获得大于5000 kDa的Pab1凝聚物，使用荧光各向异性和电泳迁移率转移分析（EMSA）测量其RNA结合能力，结果显示与Pab1单体相比，Pab1凝聚物与RNA的结合能力显著减少。

基于以上发现，研究人员开发了一种基于荧光各向异性的检测方法以监测Pab1凝聚物向功能性单体的分解，荧光各向异性的增加表明Pab1单体与RNA的结合。将Pab1凝聚物、RNA以及分子伴侣（Hsp104、Hsp70、Ⅰ型和Ⅱ型Hsp40、Hsp110）混合，在缺乏ATP的情况下，没有观察到任何变化；但是在ATP存在的情况下，荧光各向异性迅速增加，并在大约5 min后达到一个平台，标志着Pab1分解的完成。与此同时，研究人员又设计了另外两种独立实验验证了此结果，所有结果一致表明，Hsp104、Hsp70和II型Hsp40是Pab1凝聚物在体外快速、完全分解的必要充分条件。

那么Pab1凝聚物的分解与荧光素酶聚集体的分解之间是否不同？不同之处在哪里呢？研究人员揭示了两者之间四个关键差异。首先，与荧光素酶不同，Pab1不需要与小热休克蛋白Hsp26共聚合就能有效分解；其次，Ⅰ型和Ⅱ型Hsp40对荧光素酶聚集体表现出协同活性，但是Pab1凝聚物的分解仅依赖于Ⅱ型Hsp40，Ⅰ型和Ⅱ型Hsp40对其表现出拮抗活性；第三，也是最引人注目的是，解聚系统对错误折叠蛋白质聚集体的分解是缓慢且不完全的，但是却可以迅速并完全地分解Pab1凝聚物。为了深入了解这种差异的潜在来源，研究人员利用计算动力学建模，研究了以下参数的变化对底物恢复率的影响：（1）Hsp104的解聚率，（2）释放底物恢复其天然结构的效率，将其定义为分配系数，以及（3）底物对Hsp70的亲和力。模拟结果显示每一个参数在1–2个数量级上的调制都会显著影响恢复效率，而分配系数的巨大差异再现了Pab1和荧光素酶的分解差异，而且Hsp70亲和力也是一个潜在的因素，可能有助于观察到的分解效率差异。第四，与荧光素酶需要Hsp104的完全连接和展开才能解聚不同，Pab1仅部分由Hsp104连接，并在分解后很容易恢复其功能。

最后，研究人员研究了为了获得最佳活性，解聚系统对过量Hsp70的令人费解的依赖性（这一点也适用于Pab1凝聚物的分解）。研究结果表明，在凝聚物表面存在多个可被单一Hsp104分子识别的Hsp70分子，从而为标记依赖Hsp104的分解过程的凝聚物提供了一个分子标志物。利用动力学模型的结果显示，对Hsp104结合和激活的Hsp70协同效应足以解释解聚系统对Hsp70水平的内在敏感性（图1）。

图1 Hsp104/Hsp70/Hsp40解聚系统的凝聚物分解模型

综上所述，本研究表明，Pab1热诱导的生物分子聚合物是解聚系统的直接内源性底物，并创造性的指出从研究“模型”错误折叠蛋白的热诱导聚集体得出的结论并不适用于这些内源性聚合物，研究人员提示，进一步研究分子伴侣如何与这些和其他适应性内源性底物结合，以及这种结合如何不同于外源性或蛋白毒性底物，似乎有可能对这一古老分子系统的机制特征和生物学作用带来实质性的新见解。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.01.005

制版人：十一

参考文献

1. Glover, J.R., and Lindquist, S. (1998). Hsp104, hsp70, and hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell 94, 73–82.

2. Wallace, E.W.J., Kear-Scott, J.L., Pilipenko, E.V., et al. (2015). Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell 162, 1286–1298.

3. Riback, J.A., Katanski, C.D., Kear-Scott, J.L., et al (2017). Stress-triggered phase separation is an adaptive, evolutionarily tuned response. Cell 168, 1028–1040.e19.

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