抗衰机制新突破！Nutrients：刘楠教授团队揭示柚皮苷通过促进自噬和降低脂肪沉积来缓解葡萄糖诱导的秀丽隐杆线虫衰老

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关键词：揭示新突破

资讯来源：生物谷

发布时间： 2023-02-24

衰老是指生物体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象；也是一种进行性的组织器官功能衰退，目前关于抗衰老的研究大多基于活性氧（Reactive oxygen species, ROS）的产生。研究表明，许多植物化学物具有清除ROS的能力，可以在一定程度上延缓衰老的进程。柚皮苷（Naringin, Nar）是一种二氢黄酮类植物化学物，分子量580.33，分子式如图 1 所示，广泛存在于芸香科植物柚果实，特别是柚子中，具有较高的药用价值和食品保健价值，被广泛应用于医学、食品科学、化学等方面。我国是世界产柚大国，特别是在广东和福建地区，每年的产量且呈进一步快速增长态势。

图1 柚皮苷分子式

秀丽隐杆线虫（C. elegans）是一种模式生物。它体型小，生命周期短，繁殖速度快，并且具有已知的参考基因组。在生物活性物质的抗衰老机制研究中具有很大的优势。自噬是一个在进化上保守的过程，它主要的作用是清除细胞垃圾。之前的研究表明自噬可以参与调节脂代谢，植物化学物可以通过自噬来改善脂肪的积累并延长寿命，那柚皮苷是否也具有类似性质还未见报道。

由深圳大学附属华南医院刘楠教授研究团队近期发表了一篇名为“ Naringin Alleviates Glucose-Induced Aging by Reducing Fat Accumulation and Promoting Autophagy in Caenorhabditis Elegans ”的研究性论文，该文章采用全转录组测序以及GSVA发现了柚皮苷可以调节与脂代谢、寿命、生殖发育相关的通路。基于此，通过功能实验表明， 柚皮苷可以促进自噬，显著降低HGI线虫的脂肪积累，改善线粒体的功能。 使用RNAi菌株以及相应的突变株进行进一步的机制研究，在抑制了与自噬相关的基因后，柚皮苷则不能延长线虫的寿命和降低脂肪的积累。该研究成果于2023年发表在国际著名学术期刊 《Nutrients》 上，中科院二区TOP杂志。曲直副教授、余增丽教授为共同通讯作者。主要的发现如下：

1. 柚皮苷对高葡萄糖诱导(HGI)线虫的抗衰老作用

图 2 线虫在4个不同处理组的衰老相关指标分析: control, glucose (Glu), DMSO + Glu 以及 Nar + Glu。(A) 四个不同处理组线虫的生存曲线；(B) 四个不同处理组线虫的快速运动曲线；(C) 身体弯曲频率；(D) 头部摆动频率；(E) 咽泵速率；(F) 肠道自发荧光。

在高糖条件下，低剂量的Nar可以延长寿命，这表明还有其他机制有待探索，Nar还改善了与衰老相关的表型。平均快速运动跨度延长了约11%(图2B)，在线虫寿命的早期，Nar可能通过限制饮食的作用来延长线虫的寿命。此外，在第5天和第9天，喂食Nar的HGI线虫的自身荧光明显低于未喂食Nar的HGI线虫(图2F)。这些结果表明Nar对HGI线虫具有抗衰老作用。

2. 全转录组测序与生信分析揭示柚皮苷在通路水平的影响

图3 全转录组测序与生信分析。（A） “DMSO + Glu”和“Nar + Glu”两组之间的差异表达基因；（B）从GSVA结果中筛选出9条有差异的通路；（C）9条通路中下调通路的差异表达基因；（D）9条通路中上调通路的差异表达基因。

在添加和不添加25μM Nar的HGI线虫中，差异表达了2603个mRNA(图3A)， 4个lncRNA， 2个circRNA和32个miRNA。基于126条KEGG通路，基因集变异分析(gene set variation analysis, GSVA)算法显示，经Nar处理后，HGI线虫的48条通路表达水平发生显著变化，然后筛选出与研究目的相关的9条信号通路(图3B)。如脂肪代谢相关通路下调，而Wnt和TGF-β以及长寿信号通路上调。

3. 构建PPI网络筛选核心基因。

图4 PPI网络用以筛选核心基因。(A) 基于9条差异通路中的差异表达基因，使用STRING数据库构建PPI网络并使用R软件可视化。(B)基于betweenness和degree筛选出hub-gene

图3C和D显示了这些通路中的差异表达基因，为了确定合适的基因进行后续分析，对这些基因进行了蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析(图4A)。转录组学分析表明，Nar可以改善HGI 线虫的繁殖和发育(图3B)。研究发现，在第2、5和第9天，HGI线虫的的体长和宽度显著高于正常对照组(图5A和B)。有趣的是，尽管Nar处理的线虫体长在第2天比HGI对照组长，但在第5和9天却变短，这表明HGI线虫比Nar处理的线虫生长得更快。Nar确实减少了HGI线虫后代数量的下降，特别是在第3天(图5)。

4. 柚皮苷对体长、体宽、生殖的影响

基于GSVA，我们发现Wnt信号通路以及TGF-β信号通路在柚皮苷的作用下显著上调。而这两条通路与生殖和线虫的体型相关。因此我们使用体长体宽以及后代数目作为指标探索柚皮苷的机制。

图5 柚皮苷改善HGI线虫的生殖和发育。（A）第2、5、9天的体宽；（B）第2、5、9天的体长；（C）产卵期内的每日产生的后代数目；（D）线虫总的后代数目。

5. 柚皮苷对脂代谢以及自噬的影响

GSVA揭示了柚皮苷可以下调脂代谢相关通路，上调寿命相关通路。因此，我们使用qPCR测定了与这些通路相关的基因。生物信息学分析证实，Nar上调了线虫的长寿通路。我们对参与寿命调节和自噬诱导的几个关键基因进行了qPCR分析(图6D)。自噬相关基因hlh-30、lgg-1、unc-51、pha-4在Nar处理下表达显著增加。dfp标记的线虫进一步证明了Nar可以诱导自噬(图6E)。

图6 柚皮苷对HGI线虫脂代谢的影响。（A）qPCR分析验证柚皮苷对HGI线虫脂代谢相关基因的调节作用。（B）油红O染色；（C）罗丹明6G染色；（D）寿命相关基因的qPCR验证；（E）使用dFP::LGG观察柚皮苷对自噬的影响。

测序分析显示，Nar可能参与脂肪的生物合成和代谢(图3B)。因此，我们进行了qPCR，以确定几个与脂肪调节相关的基因的表达水平(图6A)。acs-2、aak-2、acs-4和nhr-49 4个基因上调，fat-7、ech-6等9个基因下调。油红O染色证实，Nar处理减弱了HGI线虫的脂肪积累(图6B)。此外，在脂肪代谢过程中会产生大量的ROS，如β-氧化，破坏线粒体功能，从而缩短线虫的寿命。脂肪堆积无疑有助于ROS的产生，Nar可以裂解过多的ROS。因此，我们通过罗丹明6G染色检测MtMP以揭示线粒体活性，结果表明Nar显著改善葡萄糖诱导的线粒体损伤(P <0.001，图6C)。

6. 敲低自噬相关基因后脂代谢的变化

图7 使用hlh-30突变株，lgg-1 RNAi, pha-4 RNAi, unc-51 RNAi等抑制自噬相关基因后，柚皮苷的脂肪降低效应消失。

先前的研究表明，自噬可参与调节脂质代谢。结合上述相关线索，我们推测Nar可能通过诱导自噬来减少脂肪积累。一个hlh-30突变体和其他三种与自噬相关的RNAi处理被用于证实我们的假设。在暴露于rnai的hlh-30、lgg-1、unc-51和pha-4线虫中，Nar没有降低脂肪的作用(图7)，同时消除了Nar的延长生命和健康的作用(图8A-H)。这意味着Nar可以改善HGI衰老。

7. 敲低自噬基因后，柚皮苷对寿命和快速运动周期无影响

图8 使用hlh-30突变株以及lgg-1, pha-4, unc-51等RNAi菌株抑制自噬基因后，柚皮苷对HGI线虫延长寿命以及快速运动周期的作用消失。

8. 柚皮苷通过SKN-1和YAP-1通路发挥作用

经Nar处理的HGI线虫寿命和Hippo信号通路基因skn-1和yap-1上调(图3D和6D)。因此，我们假设Nar可以通过调节skn-1和yap-1来降低脂肪的储存。为了验证这一假设，我们敲除了这两个基因，正如预测的那样，Nar的降脂特性消失了(图9A)。此外，在接受或未接受Nar处理的HGI线虫之间，快速运动范围和寿命不再有显著差异(图9B-E)。这些结果表明，SKN-1和YAP-1通路参与了Nar的抗肥胖和抗衰老特性。

图8. 使用RNAi菌株抑制skn-1和yap-1基因后，柚皮苷的降低脂肪含量，寿命延长以及促进健康的作用消失。

9. 柚皮苷通过促进自噬，降低脂肪含量来延长线虫的寿命的机制路线图

图10 柚皮苷通过促进自噬，降低脂肪含量来延长线虫的寿命并促进线虫的健康的机制线路图

在本研究中，我们建立了HGI秀丽隐杆线虫模型，以评估Nar给药后衰老相关表型的变化，线路图如图10所示。通过全转录组测序，我们发现与脂质调节和自噬相关的基因表达发生了显著变化，如skn-1、hlh-30、lgg-1、unc-51和pha-4基因。敲除这些基因会导致Nar降低脂肪、促进健康和延长寿命的作用消失。总的来说，我们的研究结果表明，Nar通过自噬诱导在HGI线虫中产生抗肥胖和抗衰老功能。RNA测序和qPCR证实了skn-1、yap-1和egl-44的相关基因。经Nar处理后，线虫Nrf2和YAP1同源基因在HGI虫体内表达上调。Skn-1参与调控生物活性物质引起的脂肪减少，与以往的研究一致。此外，YAP-1是高度保守的Hippo信号通路的一部分，与EGL-44结合起作用；随着yap-1表达的缺失，Nar处理不再显著降低HGI线虫的脂肪量。此外，Nar不影响具有yap-1 RNAi的HGI线虫的快速运动和寿命。

GSVA表明，TGF-β和Wnt信号通路也受Nar的调控。这两条途径控制着秀丽隐杆线虫的发育和繁殖。TGF-β通路在调节秀丽隐杆线虫的体长和宽度方面起主导作用；Nar对TGF-β的调控可能会使HGI线虫的体长在一定程度上恢复，导致Nar处理组在第2天的体长比HGI处理组更长。Nar处理的线虫的糖酵解/糖异生和柠檬酸循环(TCA循环)信号通路在通路水平上明显低于HGI线虫。因此，我们推测Nar可能抑制了葡萄糖中涉及的酶。

10. 全文总结

本研究表明，Nar可以通过刺激与自噬和脂肪调节相关的基因，改善人体健康，延长寿命，减少人体过度脂肪积累。这些结果表明，Nar作为一种营养补充剂，在改善衰老和肥胖的影响，改善人类健康方面具有潜在的能力。