带状疱疹疫苗研究开发进展

水痘和带状疱疹（herpes zoster，HZ）是由水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）感染引起的两种不同疾病。VZV初次感染后潜伏于脊髓或脑神经节中。HZ是机体免疫力降低、潜伏的VZV被激活后产生的疱疹样疾病，并导致神经组织、皮肤组织的损害。目前尚无治疗HZ的特效药，HZ疫苗可有效降低HZ发生率、复发率，减少相关后遗症和并发症。此文对已上市和开发中的HZ疫苗现状进行综述，为新型HZ疫苗研发提供参考。

水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）属于疱疹病毒科α亚科，具有嗜神经、嗜表皮和嗜T细胞特性^[1]。VZV初次感染后，感染的VZV会潜伏于脊髓或脑神经节的神经元内；在发热、肿瘤、免疫力低下等多种诱发因素作用下，VZV会被再次激活，并沿外周神经扩散，引起带状疱疹（herpes zoster，HZ）。其后遗症和并发症包括疱疹后神经痛（postherpetic neuralgia，PHN）、脑膜炎等^[2]。虽然阿昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦对HZ有一定的疗效，但是仍无针对HZ治疗的特效药。上市的HZ疫苗主要包括2种减毒活疫苗（Zostavax^®、NBP608）和1种重组亚单位疫苗（Shingrix），还有多个减毒活疫苗和重组亚单位疫苗进入临床研究，多个DNA疫苗和mRNA疫苗正处于临床前研究阶段。

VZV基因组为约125 kb的双链DNA，GC含量为46%，含73个开放阅读框（open reading frame，ORF），至少编码69种蛋白。已知的包膜糖蛋白（glycoprotein，g）有gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK、gM、gN，均与病毒的致病性和免疫原性密切相关。其中，gC与VZV毒力相关，gI、gL、gK、gM、gN与病毒传播复制和细胞融合能力呈现不同程度相关性，gE、gB、gH能诱导机体产生中和抗体^[2-3]。gE在病毒囊膜和宿主细胞膜上含量最丰富，是细胞免疫和体液免疫应答的重要靶点^[4-5]，也是开发HZ疫苗的重要候选抗原。

HZ多为散发性，无季节流行性，且发病率与年龄及细胞免疫功能状态相关。以全年龄组人群或特定地域居民HZ发病率为基础的流行病学研究发现，根据HZ累积发病率，估计发生至少1次由VZV再激活引发HZ的终生风险为10%〜30%，且发病率随着年龄的增长而显著增加^[6]。2017年北京通州区抽样调查结果显示，曾患水痘的人群占5.70%，抗VZV IgG抗体阳性率为66.78%^[7]。2018年温州龙湾区60岁以下人群抽样调查结果显示，男性和女性抗VZV IgG抗体阳性率分别为72.14%、82.89% ；15岁以下人群抗VZV IgG抗体阳性率为58.68%，而15〜59岁人群抗VZV IgG抗体阳性率高达91.23%^[8]；2017—2018年，安徽蚌埠20〜70岁人群抽样调查结果显示，20〜29、30〜39、40〜49、50〜59、60〜70岁人群抗VZV IgG抗体阳性率分别为96.15%、97.06%、93.55%、83.93%、80.00%^[9]。美国每年约有100万HZ病例，发病率随年龄增长而增加，0~14、15~29、30~39、40~49、50~59、60~69、70~79、≥80岁人群HZ发生率分别为1.1‰、1.4‰、2.0‰、2.9‰、4.6‰、6.9‰、9.5‰、10.9‰^[10]。

Kridin与Cohen^[11]研究表明，确诊HZ后3个月内HZ导致神经、眼部、皮肤和内脏并发症的风险分别增加0.48%、1.33%、0.29%和 0.78%，HZ 特异性并发症导致住院和死亡的绝对风险分别为0.97%和0.04%。PHN为HZ的临床症状中最复杂且最常见的一种，以持续性疼痛、跳痛为主，甚至还伴有痛觉过敏或是异常性疼痛，对患者生活质量产生严重影响^[12]。大多数国家往往根据PHN和HZ相关住院费用来制定HZ疫苗接种策略，目前看来，这远远低估了 HZ的实际疾病负担。

VZV在机体内潜伏和晚期基因的沉默，可能与微RNA的缺乏相关^[13]。VZV潜伏再激活的机制相对比较复杂：（1）VZV感染的靶细胞神经元和角质形成细胞也是APC，其表面的MHC I、MHC Ⅱ及胞间黏附分子1可介导细胞免疫应答^[14]。（2）VZV再激活后被模式识别受体识别，结合VZV病原相关分子模式，激活下游信号通路Toll样受体途径、髓样分化因子88途径等，分泌细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-4、IL-12等和活化T淋巴细胞亚群产生免疫应答，因而在急性期HZ会伴有细胞免疫失衡的现象，如CD4⁺ T、CD3⁺ T细胞明显降低，CD8⁺ T细胞升高，CD4⁺ T/CD8⁺ T比值降低，最后导致神经、皮肤组织的损害^[14-15]；（3）CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞在VZV的感染及激活过程中发挥重要作用^[16]。当抗原特异性T细胞减少和功能低下，导致机体内VZV再激活，致使HZ的发生^[17]。研究者们提出，早期监测CD4⁺ T细胞及观测T细胞亚群的变化有助于对病情的判定^[15]。2010年，韩科等^[18]对不同年龄段的HZ患者外周血检测结果显示，HZ患者的T细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ ）以及CD4⁺ /CD8⁺ 比值均低于正常人群，其中Th与抑制性T细胞的比值（CD4⁺ /CD8⁺）明显降低。（4）CD4⁺ T细胞在呈递病毒抗原后，能成熟分化为Th1和Th2两个细胞亚群，Th1主要分泌IL-2和IFN-γ，能有效刺激、介导细胞免疫，参与炎症反应；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-13，参与调控体液免疫应答。Th17和Treg同属独立于Th1和Th2的独特CD4⁺ T细胞亚群，Th17与Treg及其相关细胞因子可通过多种机制参与机体的抗病毒免疫应答，在HZ发病机制中发挥重要作用^[19-20]。赵阳等^[21-22]对Th17、CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺ Treg及相关细胞因子IL-6、IL-17、转化生长因子β1在HZ病程中治疗前后变化进行研究，结果显示，Th17、Treg水平在HZ患者外周血中显著增高，在治疗后显著下降，与二者相关的细胞因子水平也发生相应变化。

Zostavax^®由美国Merck&Co开发，于2006年5月被美国FDA批准上市，是首个上市的1剂量接种HZ疫苗，用于60岁及以上人群预防HZ，2011年3月获准在50〜59岁人群中使用。其疫苗毒株为Oka/Merck株，每剂病毒含量至少为19 400 PFU，是水痘减毒活疫苗病毒量的10倍。目前已在60多个国家获准使用^[23-24]。

在美国大约38 000名60岁及以上人群中开展的Zostavax^®预防HZ的临床试验研究结果显示，Zostavax^®对60~69、70~79、≥80岁人群保护效力分别为64%、41%、18%。对于22 000名50~59岁人群的临床研究显示，与安慰剂组相比，Zostavax^®组HZ发生风险降低70%。Zostavax^®上市后安全性和长期有效性研究结果显示，60岁以上人群接种Zostavax^®后，HZ发病率可降低51%。在北美和欧洲开展的Ⅲ期临床试验中，22 439名50~59岁的受试者按1：1的比例随机分为疫苗组和安慰剂对照组，疫苗组接种1剂Zostavax^®，保护效力可达69.8%^[25]。Zostavax^®接种已被证明具有较高的成本效益，长达10年的上市后监测已证实其具有中等程度的有效性和较好的安全性^[26-27]。

韩国SK Bioscience公司开发的HZ减毒活疫苗NBP608采用与Zostavax^®相同的MRC-5细胞系与Oka病毒株进行生产，旨在提供与Zostavax^®对HZ相当保护力的疫苗。2019年，Choi等^[28]在824名50岁或以上健康成年人中进行了NBP608临床试验，比较NBP608与Zostavax^®免疫原性和安全性。接种后6周，g特异性ELISA检测结果显示，NBP608与Zostavax^®组血清抗体几何平均滴度分别为1 346.37和1 674.94；酶联免疫吸附斑点检测结果显示，NBP608组和Zostavax^®组IFN-γ的几何平均斑点数（geometric mean number of spot，GMSN）分别为95.60、91.11斑点形成细胞/10⁶外周血单个核细胞，IL-2的GMSN分别为17.37、13.59斑点形成细胞/10⁶外周血单个核细胞；不良事件发生率总体为49.82%，NBP608组为50.73%，Zostavax^®组为48.91%。

HZ减毒活疫苗的保护效果随年龄增长而逐渐降低，且接种部位常伴随炎症反应，如红斑、肿胀和疼痛等症状，急需更加安全高效的HZ疫苗。

2017年10月，美国FDA批准英国葛兰素史克（GSK）公司的重组亚单位疫苗Shingrix上市，用于50岁及以上成年人预防HZ。Shingrix由冻干重组VZV gE抗原和佐剂 AS01B组成，使用前混合，肌内注射接种2剂（间隔2~6个月）。其中重组VZV gE通过中国仓鼠卵巢细胞表达，AS01B佐剂悬浮液成分包含3-O-脱乙酰基-4'-单磷酰脂质A和三萜苷（QS-21）。2017年，美国免疫实践咨询委员会建议将其作为50岁及以上人群首选HZ疫苗^[29-30]。

1项多中心、随机、安慰剂对照Ⅲ期临床试验对50岁及以上人群接种2剂Shingrix后的安全性和有效性进行了研究，50~59、60~69和≥70岁3个年龄组共15 411名受试者，其中疫苗组7 698人，安慰剂组7 713人，接种后平均随访3.2年，疫苗保护效力可达97.2%，不同年龄组保护效力相当^[31]。Cunningham等^[32]对70岁及以上人群接种2剂Shingrix的安全性和有效性进行了研究。13 900名受试者（平均年龄75.6岁）随机分为疫苗或安慰剂组，接种后平均随访3.7年，疫苗保护效力为89.8%。汇总分析结果显示，Shingrix对50岁以上人群HZ保护效力为91.3%，对PHN保护效力为88.8%。疫苗接种后7 d内，局部和全身不良反应发生率分别为79.0%和29.5%。

HZ减毒活疫苗在预防HZ中发挥重要作用，但其保护效率随年龄增长而降低，而HZ重组亚单位疫苗在50岁及以上年龄段均有较高的免疫保护效率。目前HZ疫苗的研发主要集中于新型HZ疫苗。

重组亚单位疫苗利用不同表达系统表达抗原蛋白，辅以佐剂注射至机体后产生相应的免疫应答，具有安全性好、成本低等特点，成为疫苗研发的热点之一^[33]。重组亚单位疫苗研发的关键问题有^[34-36]：（1）候选抗原的筛选。候选抗原主要具有免疫原性强、抗原稳定性强等特点。从病原学角度来看，gE、gB、gH均能诱导机体产生相应的中和抗体，其中gE是免疫原性和反应原性最强的糖蛋白，也是HZ疫苗研发重要的候选抗原。gB在膜融合中起着至关重要的作用，是抗病毒治疗的潜在新靶点，也是HZ疫苗潜在的候选抗原^[37]；（2）佐剂系统应用。目前，有5个成熟的疫苗佐剂平台^[38]：矿物盐类佐剂（如明矾）、油乳佐剂（如MF59、QS-21）、微生物和植物提取物以及衍生物类佐剂（如CpG DNA）、微粒抗原呈递系统佐剂（如脂质体、聚乙交酯、免疫刺激复合物ISCOMS、免疫刺激分子）、细胞因子类佐剂（如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）。2021年，贺蕾^[4]构建可表达VZV gE的pcDNA3.4-gE-his质粒后，选择3种复合佐剂（MF59、CpG、QS-21）与gE共同免疫小鼠。结果发现，MF59佐剂、MF59与QS-21或CpG 2006构成的复合佐剂均可以诱导较高水平的gE特异性抗体，可以作为HZ重组亚单位疫苗理想的候选佐剂。此外，植物源多糖联合铝佐剂^[39]、铝佐剂等也都是重组亚单位疫苗理想的候选佐剂。

Ad载体疫苗将抗原基因通过Ad载体呈递到宿主细胞，诱导免疫应答^[33]。相较于其他病毒载体，Ad载体具有基因毒性小、安全性好、可被改造为复制缺陷病毒载体和选择性复制的溶瘤病毒载体等优点^[40-42]。陈伟伟等^[40]采用AdEasy系统构建携带gE基因的重组腺病毒质粒pAdEasy-gE，分别以病毒滴度3.3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷感染单位（infectious unit，IFU）/ml剂量的质粒单针肌内注射免疫NIH小鼠。结果发现，免疫剂量为1×10⁷和3×10⁷ IFU/ml时，在第4周和第6周，均可引起较高水平的体液免疫应答。

DNA疫苗通过将目的抗原基因构建至质粒免疫宿主，从而获得免疫应答^[33]。DNA疫苗具有安全性高、构建周期短、能诱导较强T细胞免疫应答的特点，也是具有潜力的疫苗研发路径^[43]。研究发现，单独注射DNA疫苗免疫原性相对较低，特别是在大型动物模型和人类中更明显。为改善这种情况，现在已经开发出了能够增强DNA摄取、表达和免疫原性的其他接种方式，包括各种递送装置，例如基因枪、无针注射装置和体内电穿孔装置^[44]。周旭等^[45]分别构建了gH和gL重组真核表达质粒，于第0、3、5周用质粒单独或与CpG1826佐剂共同免疫小鼠。结果发现，仅双质粒与佐剂共免疫组小鼠血清显示出中和活性，即gH-gL复合物具有一定的免疫原性，同时gH也是HZ疫苗潜在的候选抗原。林俊杨^[43]采用pcDNA3.1质粒构建3种含有gE和IE63基因序列的DNA疫苗，以50 μg CpG寡聚脱氧核苷酸1826（CpG-ODN1826）为佐剂，肌内注射接种小鼠，可诱导产生较高水平的gE特异性IgG抗体。Kim等^[44]用插入VZV gE、IE63或IE62基因的重组DNA质粒免疫C57BL/6小鼠发现，3种DNA疫苗均可诱导产生较强的VZV特异性CD4⁺ T细胞免疫应答；与编码IL-7或IL-33的DNA质粒共接种，VZV特异性CD4⁺ T细胞应答明显增强。在单剂量免疫质粒后2周，用1×10⁷ PFU表达gE的痘苗病毒（VV-gE）对小鼠进行攻毒，攻毒后第2天和第5天，小鼠卵巢VV-gE滴度分别下降至4×10³、1×10² PFU。

mRNA疫苗将外源目的基因通过体外转录技术制备的mRNA以特定的递送系统递送至宿主细胞，表达目的蛋白，进而产生特异性免疫应答。相较于DNA疫苗，mRNA疫苗具有高安全性、高免疫应答性等优势，是疫苗研发方向的亮点^[35]。同时，mRNA疫苗研发具有几大挑战^[46]：（1）mRNA序列设计及稳定性。由于mRNA极易被RNA酶水解代谢失活，因此mRNA序列设计及稳定性是mRNA疫苗研发和生产的挑战之一；（2）递送系统。人体内环境复杂，mRNA能否被安全准确递送至胞内也是mRNA疫苗有效性的关键，故而递送系统是否有效也极为关键；（3）质量控制。模板DNA的残留和mRNA不完全合成表达，也是mRNA疫苗研发的难题。Monslow等^[47]将预免疫28 d VZV减毒活疫苗（19 400 PFU）的成年健康恒河猴随机分为2组，第1组比较不同类型疫苗接种后免疫原性：脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）包裹编码VZV gE 抗原的 mRNA 疫苗（VZV gE mRNA/LNP）50、100、200 μg 接种各 5 只，19 400 PFU VZV减毒活疫苗接种4只，50 μg VZV gE亚单位佐剂疫苗接种5只（间隔28 d加强接种2剂）；第2组比较不同剂量VZV gE mRNA/LNP接种后免疫原性：100、200、400 μg接种各5只，间隔28 d，加强接种2剂。结果显示：（1）不同类型疫苗接种70 d后，抗体水平以大致相同的速度衰减，但仍高于接种前；（2）在接种后第42天和第70天，100和200 μg剂量的mRNA疫苗、50 μg剂量的VZV gE亚单位佐剂疫苗组的抗体亲和力分别为0.18、0.20、0.18和0.30、0.32、0.25，明显高于减毒活疫苗（0.12、0.21）；（3）VZV gE mRNA/LNP 疫苗接种后抗体水平与剂量呈正相关；（4）在加强接种后第70天检测IFN-γ、IL-2、TNF，发现50、100、200 μg剂量的VZV gE mRNA/LNP组和减毒活疫苗组的小鼠血清CD4⁺ T细胞中IFN-γ阳性率分别为35%、40%、75%、10%，IL-2阳性率分别为55%、45%、62%、2%，TNF阳性率分别为52%、50%、83%、10%。由此可见，50、100、200 μg剂量的VZV gE mRNA/LNP诱导的细胞免疫水平高于VZV减毒活疫苗。

HZ造成的疾病负担引起全球极大的关注，安全、有效、可及的HZ疫苗也成为全球研发热点。已上市的HZ减毒活疫苗免疫效果低于亚单位疫苗，且病毒含量是水痘减毒活疫苗的10倍左右，产量受到一定限制；已上市的亚单位疫苗中佐剂虽然会提高疫苗的免疫原性，但佐剂本身存在的免疫刺激和接种依从性问题，一定程度上也会限制亚单位疫苗的使用。mRNA疫苗可诱导产生较强的细胞免疫应答，其进入机体后可以直接表达抗原，不存在DNA疫苗有可能整合至宿主基因组的风险，具有较大的研究应用前景，值得关注。另外，合适的动物模型选择和感染模型的建立对于HZ疫苗临床前评价研究十分重要。

孙惠敏¹ 综述    李秀玲² 审校

¹上海生物制品研究所有限责任公司第四研究室，上海 200051；²上海生物制品研究所有限责任公司，上海 201403

通信作者：李秀玲，

Email：lixiuling@sinopharm.com

引用本文：孙惠敏，李秀玲. 带状疱疹疫苗研究开发进展 [J]. 国际生物制品学杂志，2023，46(1)：55-60.  

DOI：10.3760/cma.j.cn311962-20220610-00030