Nature Methods | 殷昊课题组开发不依赖DNA供体高效靶向插入基因组的新方法：GRAND editing

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大部分遗传疾病都存在基因缺失或者部分序列错误，靶向性基因插入是治疗疾病的最佳方案之一。如何高效定点插入大片段DNA序列也成为基因编辑领域的难点和热点。利用CRISPR基因编辑技术进行靶向插入的经典方法主要是同源重组修复，这种方法通过提供一个外源DNA供体，利用细胞自身的同源重组修复机制实现外源DNA片段的插入【1】。由于同源重组修复过程主要发生在细胞有丝分裂的S/G2期，限制了在非分裂细胞中的应用。相较于同源重组介导的片段插入，利用非同源末端连接虽然可以在非分裂细胞中实现片段插入，但由于存在效率低、副产物比率高的问题，无法达到有效插入【2,3】。因此，寻找一个不依赖细胞周期、高效靶向插入DNA片段的工具有重要意义。

2022年2月28日，武汉大学医学研究院、教育部免疫和代谢前沿科学中心殷昊课题组在Nature Methods上发表了题为Efficient targeted insertion of large DNA fragments without DNA donors的研究论文，在Prime editing基础上，开发了一个由全新机制所介导的高效靶向插入系统：GRAND editing。

Prime editing是2019年Broad研究所David. Liu团队研发出的一种可以在人类细胞进行12种碱基间变换，以及小片段插入和删除的基因编辑工具【4】。Prime editing通过在nCas9 (H840A) 基础上连接逆转录酶，在含有RNA模板的pegRNA引导下，可实现不依赖外源DNA供体的小片段靶向插入（图1，左）。由于其最长插入片段仅为44 bp, 无法满足大片段DNA精准插入的需求。

基于prime editing不需要DNA供体的优势，研究者们利用一对特殊的pegRNAs实现20-1000 bp 大小的DNA片段靶向插入，该系统又称为GRAND Editing（genome editing by RTTs partially aligned to each other but nonhomologous to target sequences within duo pegRNA）（图1，右）。利用GRAND Editing系统，研究者们在不同细胞系的多个基因组位点证明，当插入片段大小为150 bp，精准插入效率可达约60%，当片段为250 bp时，插入效率也高达约30%，并且此方法所产生的副产物很低，并检测不到脱靶。值得指出的是，研究者们在非分裂细胞中证实GRAND editing可以不依赖于DNA供体进行长片段序列的精准插入。

研究者们巧妙地利用一对特殊设计的pegRNAs来实现目的片段的靶向插入。这两条pegRNAs 的3’端携带的逆转录模板（reverse transcription template, RTTs）含有一段碱基互补配对区域，并且2个RTT均和基因组的靶向位点无任何同源序列。当RT酶通过pegRNA 3’末端的PBS（primer binding site）起始逆转录过程，产生2条末端互补配对的单链DNA。这两条单链DNA通过互补配对产生了一段稳定的双链DNA结构，这样的编辑链和原始的基因组链之间相互竞争中具备优势，从而实现了外源片段的高效插入。同时，因为GRAND editing中的RTTs不需要与基因组同源配对，可以在Flap长度相同的情况下插入更长的外源片段。

图1  PE3和GRAND Editing 靶向插入外源DNA片段的设计概览图

研究者们首先在EGFP位点上验证了GRAND editing插入20 bp 到约1000 bp DNA片段的可行性。研究者们设计了靶向插入bsd基因和补全破损的EGFP基因的实验，证明了GRAND editing可插入功能性基因或基因片段。研究者们进一步利用GRAND editing系统在多个内源性位点上均实现了高效靶向插入基因组，并且编辑的副产物占比很低。在与Prime editing的高效版本PE3比较中，GRAND editing对于长片段靶向插入能力远高于PE3。研究者们在数种细胞系中的多个位点和非分裂细胞中均证实了GRAND editing精准插入长片段的能力。在对机制的探索中，研究者们发现GRAND editing需要以下几点的组合：一对pegRNAs；pegRNAs的RTTs部分互补；pegRNAs与靶向的基因组无互补序列；2个nicks间的序列需要删除等。

遗传缺失和单核苷酸多态性 (SNPs) 占已知人类基因组致病变异的80% 以上【5】。每个遗传病的致病基因通常具有几十到几百个会造成病理表型的SNPs。但是通常由于携带每种突变的患者人数非常有限，很难针对单个SNP开发基因编辑药物。从实际情况出发，靶向插入基因序列或替换含突变热点的外显子是更理想的治疗方案。本研究开发了一种高效靶向插入大片段的方法，为遗传病的基因治疗和分子生物学研究提供新工具。因其无需DNA供体，可以RNA形式进行体内递送，实现体内定点插入，有利于基因药物开发。

本论文的第一作者为武汉大学医学研究院的研究生王金琳、何周、王国权和张瑞文。本项研究获得了武汉大学医学研究院的仪器设备共享中心和武汉大学中南医院的支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01399-1

制版人：十一

参考文献

1. Filippo, J. S., Sung, P. & Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry 77, 229-257 (2008).

2. Suzuki, K. et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature 540, 144-149 (2016).

3. Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N. & Yang, Y. Obligate Ligation-Gated Recombination (ObLiGaRe): Custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research 23, 539-546 (2013).

4. Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019).

5. Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research 42, D980-985 (2014).

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