Science | 突触中的镶嵌表达——揭秘X连锁PCDH19突变疾病的分子机制

撰文丨十一月

责编丨酶美

X染色体连锁的基因PCDH19（Protocadherin-19）突变会造成PCDH19疾病相关的癫痫。PCDH19障碍通常还伴随着认知损伤，其中70%的病人具有智力方面的缺陷【1】。通常来说，由于X连锁的隐性遗传，X连锁疾病在雄性中表现出更严重的表型。但相反的是PCHD19突变引发的障碍会在杂合子的雌性中表现疾病的特征，而在半合子的雄性中则没有太明显的症状。此种不同寻常的情况为何会出现还不得而知。

为了揭开这一问题的谜底，美国哈佛医学院Hisashi Umemori研究组在Science发表了研究论文，题为Female-specific synaptic dysfunction and cognitive impairment in a mouse model of PCDH19 disorder，揭开了PCHD19突变在杂合子雌性而非雄性中表现出认知障碍等疾病特征的具体分子机制。

关于PCHD19突变引发的障碍在雌性和雄性中的表现不同这一特征，曾有研究猜测可能是由于杂合的雌性细胞中既有表达野生型的细胞，也有表达突变型PCDH19的细胞，由于X染色体随机失活，因此可能是由于PCDH19的嵌合表达引起致病症状【2】。PCHD19基因编码的是一个单次跨膜蛋白，属于原钙粘附因子家族。PCDH19通过细胞外钙粘蛋白结构域的亲同性结合介导钙依赖的细胞与细胞之间的粘附。PCHD19基因中大多数与疾病相关的突变都会破坏PCDH19的胞外结构域。

为了对PCDH19在脑部的功能进行解析，作者们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对Pcdh19进行失活。同时为了对PCDH19的表达进行解析，作者们构建了PCDH19的抗体。通过PCDH19抗体染色，作者们发现主要表达在小鼠的脑部（图1）。在海马区，苔藓纤维（Mossy fiber）通路中富含PCDH19蛋白。PCDH19在苔藓纤维突触的突触前和突触后神经元中均有表达。进一步地，通过对苔藓纤维中的细胞标记物进行免疫染色作者们确认PCDH19表达的确位于苔藓纤维突触之中。

图1 PCDH19的结构示意图与在小鼠不同组织中的表达特点

进一步地，作者们希望对Pcdh19突变小鼠的表型进行检测。作者们发现Pcdh19突变雌性小鼠中的确出现异常的Pcdh19+与Pcdh19-皮层神经元的聚集，这与先前的研究是一致的【3】。但是作者们发现突变并不会影响苔藓纤维轴突的长度，也不会影响基础苔藓纤维的强度。但是作者们发现Pcdh19突变雌性小鼠中神经递质释放的能力显著降低，但是Pcdh19突变雄性小鼠中则没有此现象。因此，Pcdh19突变雌性小鼠会出现特异性的突触功能和可塑性的损伤。而且，作者们发现这种特异性的损伤会引发Pcdh19突变雌性小鼠中出现认知功能障碍。

那么，Pcdh19突变雌性小鼠中特异性苔藓纤维突触功能障碍和认知损伤的分子机制是什么呢？由于雄性半合子中并没有表现出苔藓纤维突触功能障碍，因此仅凭PCDH19之间缺乏同质性相互作用并不能解释这种缺陷。为此，作者们希望找到其他与PCDH19相互作用的因子。由此，作者们重点对PCDH19与N-cadherin之间的相互作用进行研究，N-cadherin是另一种定位于突触的细胞黏附分子【4】。为了对该假设进行验证，作者们首先对PCDH19与钙粘素之间的相互作用进行检测。作者们发现在海马区PCDH19与钙粘素之间的确存在相互作用。

但是PCDH19与N-cadherin形成的复合物在维持苔藓纤维中突触的正常功能的呢？作者们建立了一个人人类胚胎肾细胞HEK细胞与神经元共培养系统，可以通过HEK细胞表达突触发生相关的因子，诱导接触的轴突的突触前分化。HEK细胞中内源并不表达PCDH19，只表达N-cadherin。在HEK细胞中作者们同时过表达PCDH19以及N-cadherin或者只表达N-cadherin，在此情况下构建出了一个PCDH19与N-cadherin匹配或者错配的实验体系（图2）。该结果证实，PCDH19与N-cadherin的错配的确会损害突触前的发育过程（图2）。而且，PCDH19与N-cadherin的错配主要影响Pcdh19突变雌性小鼠中β-catenin的斑点的密度和尺寸，从而显著地影响苔藓纤维突触的功能。

图2 利用HEK细胞与神经元细胞进行PCDH19与N-cadherin之间错配的检测

总的来说，该工作发现Pcdh19突变雌性小鼠而非Pcdh19突变雄性小鼠中出现苔藓纤维突触前功能障碍和认知缺陷主要是由于PCDH19与N-cadherin的错配，进而损害N-cadherin依赖的信号通路，损害突触前发育过程（图3）。野生型Pcdh19与和Pcdh19突变雄性小鼠中由于与PCDH19或N-cadherin相互作用匹配而被保留（图3）。该研究不仅揭示了独特的雌性特异性疾病机制，而且提出了基于此分子相互作用的可能策略来进行疾病的治疗。

图3 工作模型（来自当期评论文章Mosaic synapses in epilepsy）

原文链接：

https://doi.org/10.1126/science.aaz3893

制版人：十一

参考文献

1 Dibbens, L. M. et al. X-linked protocadherin 19 mutations cause female-limited epilepsy and cognitive impairment. Nature genetics 40, 776-781, doi:10.1038/ng.149 (2008).

2 Depienne, C. et al. Sporadic infantile epileptic encephalopathy caused by mutations in PCDH19 resembles Dravet syndrome but mainly affects females. PLoS genetics 5, e1000381, doi:10.1371/journal.pgen.1000381 (2009).

3 Pederick, D. T. et al. Abnormal Cell Sorting Underlies the Unique X-Linked Inheritance of PCDH19 Epilepsy. Neuron 97, 59-66.e55, doi:10.1016/j.neuron.2017.12.005 (2018).

4 Tai, C. Y., Kim, S. A. & Schuman, E. M. Cadherins and synaptic plasticity. Current opinion in cell biology 20, 567-575, doi:10.1016/j.ceb.2008.06.003 (2008).

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