专家点评Nat Biomed Eng | 李晓江/李世华/闫森/赖良学合作利用基因编辑治疗神经退行性疾病大动物模型

点评 | 鲁伯勋（复旦大学）、申勇（中国科学技术大学）、X. William Yang（加州大学洛杉矶分校）

衰老是不可控的生物学进程，随着医疗条件改善及社会经济的发展，人们的寿命显著增加，人口老龄化成为世界面临的巨大挑战。越来越多的老年人罹患神经退行性疾病，包括老年痴呆  (Alzheimer’s disease ) 、帕金森病 （Parkinson’s disease, PD） 、肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 以及单基因突变导致的遗传性亨廷顿疾病 （Huntington’s disease, HD） 等。这一类疾病的共同特征是随着衰老出现脑部特异性神经细胞变性死亡最终导致病人无法生存。目前仍然缺乏有效治疗手段来延长或阻断病人的发病时间及疾病进程。基因治疗对于遗传性疾病，特别是单基因突变导致的神经退行性疾病，是一种前景非常可期的治疗策略。

2023年2月16日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授，李世华教授，闫森研究员，联合中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员在Nature Biomedical Engineering上发表题为  Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington’s disease  的研究论文 。 该工作利用AAV病毒载体表达CRISPR/Cas9基因编辑的技术修复及敲除亨廷顿猪模型的突变基因，首次在国际上证明基因治疗能有效的改善神经退行性疾病大动物模型的病理变化以及行为症状。

李晓江教授团队曾在2017年首次报道 CRISPR/Cas9可以有效治疗亨廷顿疾病小鼠模型 (Yang et al., 2017 J Clin Invest) 。然而， 基因修饰的亨廷顿疾病小鼠模型并不表现出明显的神经细胞死亡特性。这一缺陷妨碍了利用小鼠模型来严格评价药物及基因治疗的有效性。由于大动物模型在大脑和结构功能上与人类更为相似。李晓江教授团队与赖良学研究员团队在2018年建立了国际首例基因敲入猪模型来模拟亨廷顿病的典型神经细胞死亡特性与运动功能障碍 （Yan et al., 2018 Cell） 。该模型为基因治疗神经退行性疾病提供了一个重要的动物模型。

利用这个基因敲入猪模型，闫森等研究人员通过CRISPR/Cas9引起的同源臂重组将变异亨廷顿基因序列替换为正常人亨廷顿基因序列。同时还测试了脑部直接注射及周围静脉注射AAV病毒载体携带的CRISPR/Cas9对亨廷顿疾病模型猪的治疗作用， 两种方法都可以把变异亨廷顿基因序列替换为正常基因序列, 并能有效治疗大动物模型的病理变化以及运动症状。同时，该研究从多方面评估了这一治疗方法的安全性。亨廷顿疾病模型猪基因治疗的方式也为治疗其他神经退行性疾病提供了理论基础与新的思路。

图 （A） 足印试验表明亨廷顿疾病模型猪（右侧猪）的运动障碍步及态紊乱可以通过脑注射AAV病毒载体表达CRISPR/Cas9对突变基因的修复而得到纠正（左侧猪）。(B) 基因治疗减少HD猪纹状体中的神经细胞死亡。（C）基因治疗改善HD猪脑纹状体中的基因表达缺陷。

暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授，李世华教授，闫森研究员与中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员为本文的共同通讯作者。闫森研究员为本文的第一作者。涂著池研究员，博士生郑潇，林颖琪，李彩娟，李嘉威，助理研究员刘朝明，赵宇等也为本研究做出重要贡献。

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鲁伯勋 （复旦大学）

作为单基因突变导致的神经退行性疾病中的代表，亨廷顿疾病（Huntington’s disease, HD）的治疗研究一直被生物医药领域关注。由于其致病基因及蛋白明确，也被认为是最有可能进行根本性治疗的神经退行性疾病。在理论层面，由于该疾病的根源是HTT基因的突变，因此如果能将该突变基因修复，则可从根本上治疗疾病。然而，自亨廷顿病的致病基因发现30年以来，目前尚无任何根本性的治疗手段，凸显了这一问题的重要性和难度。要解决该问题，需要高度模拟疾病成因和表型的疾病模型，以及合适的修正突变基因的技术手段。暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授和李世华教授团队在此方向上深耕多年，取得了一系列突破性的进展。例如首次构建了亨廷顿病猴模型（Nature 2008），首次证明了利用CRISPR/Cas9敲除突变HTT基因可有效改善亨廷顿小鼠动物模型的行为学表型（Journal of Clinical Investigation 2017）,构建了国际首例亨廷顿病基因敲入的猪模型（Cell 2018）等。特别值得一提的是团队带领闫森研究员等成员构建的猪模型（Cell 2018），可以很好地模拟亨廷顿病的典型神经细胞死亡特性与运动功能障碍，相比缺乏典型神经死亡表型的疾病小鼠模型有着独特优势，也为疾病干预研究提供了最好的模型。

在最新的研究工作中，利用这个基因敲入猪模，团队与中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员团队合作，成功通过基因编辑技术将变异亨廷顿基因序列修正为正常人亨廷顿基因序列，并观察到了对该模型多种疾病相关病理变化以及运动症状的拯救。我认为该研究有多个亮点：1. 首次在成年大动物模型验证了基因编辑对疾病根本性干预的作用，为今后的临床试验提供了目前最有力的有效性证据；2. 通过测试证明了脑部直接注射及周围静脉注射两种基于AAV病毒载体均有效，为外周给药进行亨廷顿病的基因治疗提供了概念性验证，可能将大大降低临床试验在给药方式的面临的挑战；3. 概念性验证了利用同源重组将突变序列修复成正常序列的可能性，为亨廷顿病的基因治疗提供了新的策略；4. 从多方面评估了这一治疗方法的安全性，为今后的临床试验奠定了良好的基础。最后，该研究也证明了降低突变基因的表达可有效拯救疾病，为靶向降解变异HTT蛋白的小分子药物的潜力价值提供了依据。利用小分子药物干预致病蛋白治疗疾病虽然没有基因编辑彻底以及持久，但是具有易口服和价格相对便宜的优势。希望今后有机会得到效果更好的小分子药物后能在亨廷顿病猪模型中进行药效研究。

综上所述，该研究为利用基因编辑最终攻克亨廷顿病提供了里程碑式的临床前证据，为亨廷顿病患者的根本性治疗提供了曙光，希望能早日看到团队的成果运用于患者。

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申勇 （中国科学技术大学）

在现代生物学研究中, 基因组编辑技术是一种通过人工设计和改造核酸酶达到对基因组进行定点修饰的技术，通过将与gRNA复合的 Cas9核酸酶递送到细胞中，可以在特定的基因区域进行编辑，从而在体内改变现有基因。暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授，李世华教授，闫森研究员，联合中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员在国际上匠心独具，通过使用AAV病毒载体表达CRISPR/Cas9进行基因编辑来敲除亨廷顿猪模型的突变基因，有效的减少了突变蛋白的产生，减轻疾病症状，为亨廷顿病患者的根本性治疗提供了曙光。

此项研究首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于大动物模型。大动物模型在模拟神经退行疾病方面有其优越性。可以更好的模拟出病人脑中的典型病理变化，例如神经细胞死亡。早在2018年，李晓江团队与赖良学团队就构建了国际首例能很好模拟病人脑内神经细胞死亡特性的亨廷顿病基因敲入猪模型。此次又首次证明了利用CRISPR/Cas9敲除突变基因可有效地改善亨廷顿大动物模型的神经细胞死亡及行为学表型。这一工作不仅证实了CRISPR/Cas9在单基因突变疾病上的良好治疗作用，也为应用CRISPR/Cas9进行治疗其它神经退行性疾病的大动物（猪，猴）疾病模型奠定了基础。

该研究成果验证了基因治疗技术是单基因突变疾病的一剂良方，通过一次性给药彻底改变突变基因位点，为挽救神经退行性疾病患者带来了新的希望。在以往检测基因治疗亨廷顿动物模型的实验中，往往都是通过大脑或脊髓直接注射基因修饰工具来降低突变基因的表达水平，然而这种方式需要进行脑部注射，在临床上应用的话，有手术风险性。为此，研究团队还通过静脉注射AAV病毒载体表达的CRISPR/Cas9， 发现也能进入亨廷顿病猪脑内，与脑部直接注射的方式相似，也可以将动物脑内的突变基因转换为正常基因，并且有效的缓解亨廷顿病猪模型的运动障碍及改善神经细胞死亡的病理变化。静脉注射的给药方式避免了脑注射所带来的风险。这一最新研究成果在大动物水平上证明了CRISPR/Cas9这一精准、高效、安全的新型技术，为进一步在临床上运用打好基础。由于其它神经退行性疾病例如帕金森病和阿尔兹海默症也可因单基因突变造成或极大地增加患病的风险，本研究为治疗其它神经退行性疾病也提供了很好的新思路。

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X. William Yang （加州大学洛杉矶分校 ）

The study by Yan et al (2022) is a momentous step forward in the development of a CRISPR/Cas9-mediated genome editing treatment for an inherited neurodegenerative disorder, Huntington’s disease (HD). As a monogenic disorder without effective treatment, HD has been a model for studying neurodegenerative disease mechanisms and testing innovative therapeutics. Currently, there is a concerted effort by the academia and industry to deliver a variety of genetic or small-molecule therapies into HD patient brains to reduce the expression of mutant Huntingtin, the root cause of the disease. In this context, it is unsurprising that HD has often been mentioned as a top candidate for testing the revolutionary CRISPR/Cas9 genome editing technology in the treatment of a brain disorder. However, efforts thus far have been limited to testing genome editing in HD patient cells in a dish or HD mouse models, and the readouts are often limited to the levels of the mutant Huntingtin transcripts or proteins. Therefore, much is unknown about the safety, efficacy, and delivery method in a genome editing treatment for HD, and whether approaches in rodent models of HD can be translated into a larger animal or patients. In this context, the research reported by Drs. Shihua Li, Xiao-Jiang Li, Liangxue Lai and colleagues is remarkable for several reasons. First, this is the first demonstration that CRISPR/Cas9 can be safely and effectively delivered by AAV viral particles into the brain of a large animal model of HD to reduce the disease-causing protein, in this case transgenically expressed human mutant Huntingtin. Importantly, the authors showed that the delivery route of direct brain injections or intravenous injections are both effective in therapeutic editing of mutant Huntingtin. Second, the study shows a subset of mutant Huntingtin in the HD minipig brains can also be “repaired” back into wildtype nonpathogenic form of Huntingtin, which helps to preserve its normal function. Most impressively, the study shows CRISPR/Cas9-mediated lowering of mutant Huntingtin or restoring wildtype Huntingtin function rescues behavioral deficits, neuropathology, and impaired gene expression in the HD minipig model. Together, this study provides pivotal proof-of-concept to support the further pursuit of an AAV-mediated genome-editing therapy for HD and likely other genetic forms of neurodegenerative disorders.

闫森等人 (2022) 的研究是利用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑治疗遗传性神经退行性疾病亨廷顿舞蹈症 (HD)所迈出的重要一步。HD是一种尚无有效治疗的单基因疾病，一直是作为研究神经退行性疾病机制和测试创新疗法的疾病模型。由于突变亨廷顿蛋白是造成该疾病的根本原因，学术界和工业界一直在共同努力将各种基因或小分子疗法输送到 HD 动物模型和患者的大脑中以减少突变亨廷顿蛋白的表达。因此，HD 经常被作为最佳模型来测试评价创新性 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术治疗脑部疾病。然而，迄今为止的努力仅限于在培养皿或 HD 小鼠模型中测试HD突变基因的编辑与修复，并且测试指标仅限于突变亨廷顿基因的表达水平。关于 HD 基因编辑治疗的安全性、有效性和递送方法，以及 HD 啮齿动物模型中的方法是否可以转化为运用到大动物及患者体内，还有很多未知数，亟需被证明。因此，李世华， 李晓江及赖良学合作团队的研究成果尤其引人注目。首先，这是第一次证明 CRISPR/Cas9 可以通过 AAV 病毒载体安全有效地递送到大型 HD 动物模型的大脑中，并减少因致病基因敲入后所表达的毒性蛋白。重要的是，作者证明直接脑内注射或静脉内注射的递送途径对突变亨廷顿基因的治疗性编辑均有效。其次，该研究表明HD 小型猪大脑中的一部分突变亨廷顿基因也可以“修复”回野生型非致病性亨廷顿基因，这有助于保持正常亨廷顿基因的功能。最令人印象深刻的是该研究表明 CRISPR/Cas9 介导的突变亨廷顿蛋白的降低或野生型亨廷顿蛋白功能的恢复可挽救 HD 小型猪模型中的运动功能缺陷、神经病理学和基因表达受损。总之，这项研究验证了重要理论及支持进一步利用 AAV 介导的基因编辑治疗 HD 和可能的其他遗传型神经退行性疾病。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-023-01007-3

制版人：十一

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