专家点评Science重要突破 | 建物致知：李伟/周琪团队联合开发染色体编辑新技术，创建全新核型小鼠

点评 | 张晓宇，李劲松（中国科学院院士）

责编丨酶美、迦溆

染色体是遗传物质DNA的主要载体，其在细胞中的组成及形态特征被称为核型 （染色体组型） 。不同的物种具有不同的核型，但是同一物种的核型是高度保守的，以常用的实验动物小鼠为例，自人工繁育至今一百多年来所有的小鼠品系都维持了标准的40条染色体的核型。但是在漫长的生物演化过程中，染色体会发生重排，啮齿类动物每百万年就会积累3.2-3.5种染色体重排，而灵长类动物在每百万年也会积累1.6种染色体重排。最典型的例子是灵长类动物进化过程中，两条端着丝粒染色体通过罗伯逊融合形成了人类的2号染色体，而这两条染色体在黑猩猩中却仍然是分离的，因此人类有46条染色体，但黑猩猩却有48条染色体【1】。进化生物学家认为染色体重排可能是导致生殖隔离建立的原因，甚至可能是物种产生的重要驱动力 【2, 3】 ，但是这一假设尚未通过实验生物学的手段进行证明。除了对于物种进化的重要意义，个体水平上发生的染色体重排往往会导致疾病的发生，如单亲二倍化，不孕不育和儿童白血病等等。因此，在实验室建立精准的染色体重排工程技术，对于研究染色体重排在物种进化、个体生殖发育与疾病中的作用具有重要价值。

近些年，随着基因组编辑技术的进展，染色体精准重排率先在基因组组成简单且为单倍体的酵母上获得成功【4, 5】。但是哺乳动物基因组比酵母基因组复杂得多，目前对哺乳动物染色体的重排只限于亚染色体水平，在哺乳动物上进行完整染色体的重排仍然面临巨大挑战。

2022年8月26日，Science杂志以长文形式在线发表了中国科学院动物研究所，北京干细胞与再生医学研究院李伟研究员和周琪研究员团队合作完成的题为 A sustainable mouse karyotype created by programmed chromosome fusion 的研究论文， 报道了 哺乳动物完整染色体可编程连接的新技术，创造出具有全新核型的小鼠，实现了哺乳动物大规模基因组DNA的编辑，在实验室中成功模拟和解析了染色体重组的生物学效应。

在哺乳动物细胞中如何将两条完整的非同源染色体连接为一条？哺乳动物染色体通常按照大小顺序由大到小 （性染色体除外） 进行编号。研究人员利用小鼠单倍体干细胞和Crispr基因编辑工具，将最长的染色体1号和2号 （包括正反两种形式） 、以及中等长度的5号和4号染色体首尾连接，并且确定了连接的方式为非同源末端连接，如图1A所示。为了更加直观地观察到染色体的连接，作者通过染色体DNA-FISH，核型分析，以及HiC等方式进一步确认了染色体的连接，同时发现染色体连接过程中可能会发生染色体的断裂和重新连接，如图1B所示。这些结果表明两条独立存在的染色体可以通过基因编辑后非同源末端连接修复的方式连接为同一条染色体。

图1 小鼠单倍体干细胞染色体连接.（A）染色体连接示意图（B）染色体连接DNA-FISH鉴定结果

染色体重排连接会对细胞的表型产生什么影响？前人研究发现并提出相关假说：染色体长度、细胞核大小和细胞大小三者存在内在的关联和调控，但是关联方式和调控机制仍然不清晰。研究人员发现染色体连接后干细胞的多能性基因表达以及分化没有发生明显的变化；但是最长染色体连接 （1号和2号染色体连接） 的单倍体干细胞二倍化速率显著加快；而且这种染色体倍性的变化趋势不仅存在于单倍体细胞，在已经成为二倍体的胚胎干细胞及神经干细胞中，携带最长染色体连接 （1号和2号染色体连接） 的细胞仍会发生自发多倍化。为了探究这一现象发生的机制，研究人员通过免疫荧光染色的方法对连接细胞的有丝分裂进行观察，发现有丝分裂末期连接的染色体会发生染色体桥联现象。那么是否是因为染色体长度过长而导致有丝分裂末期姐妹染色单体不能正常分离，进而造成细胞不能正常分裂而核型加倍？为了确定这一假设，研究人员对连接的染色体分别进行截断和恢复，结合染色体分离的实时观察确认了染色体长度过长是导致细胞分裂异常的原因。综合以上分析进行推论，哺乳动物细胞的染色体长度可能存在一定限制，这种染色体长度限制与细胞的大小有关；对小鼠细胞而言，染色体长度上限范围可能在308.3Mb – 377.6Mb之间。

染色体重排连接会对小鼠的表型产生什么影响？为了回答这一问题，研究人员通过单倍体干细胞注射卵母细胞的方式成功得到染色体连接的小鼠，如图2所示。研究发现，不同的染色体连接对小鼠产生了不同的影响，其中最长的染色体连接使得胚胎发育不能正常进行，胚胎停滞于E12.5之前；而染色体断裂重新连接的小鼠则表现出了生长曲线和行为学的异常；但4号和5号染色体连接的小鼠则没有表现出明显的异常。染色体重排是否以及如何影响生殖呢？研究发现连接后的染色体能够传递到后代小鼠，并且进一步交配可以产生纯合小鼠，即只有19对染色体的全新核型的小鼠， 证明两条染色体的连接不会导致绝对的生殖隔离。 但是携带连接染色体的小鼠生殖力明显下降，进一步探索发现连接后的染色体仍然能够与两条分离的同源染色体进行正常联会，但是联会后的同源染色体分离会出现异常。这些发现解析了染色体连接会对小鼠发育、行为和生殖等产生多方面的影响，对于了解染色体重组如何影响物种的进化具有重要的参考价值。

图2 染色体连接小鼠，携带有4号和5号染色体连接的小鼠。

最后，研究人员还综合分析了染色体空间结构在胚胎干细胞，神经干细胞和脑内的变化趋势，发现随着分化的进行，染色体的空间结构变化随着分化而减弱。

综上所述， 该研究首次建立了哺乳动物完整染色体可编程连接的新技术，实现了对于超大规模基因组的编辑，为哺乳动物合成生物学增添了新的技术手段。同时，该工作发现了染色体长度的限制，为哺乳动物合成生物学进行染色体设计合成提供了重要参考。通过在实验室小鼠模型中模拟染色体重排事件，研究了染色体重排的生物学效应，为进化生物学研究提供了重要参考，为染色体异常疾病研究提供了模型构建的方法。

中国科学院动物研究所博士后王立宾，副研究员李治琨，博士后王乐韵，博士后许凯和博士生季甜甜为本文的共同第一作者。中国科学院动物研究所与北京干细胞与再生医学研究院的李伟研究员，周琪研究员为本文共同通讯作者。参与本课题的还有中国科学院动物研究所的毛伊幻，马思楠，刘超，王丽颖，舒由嘉，杨宁以及安诺优达基因科技有限公司的刘涛，涂成芳，赵倩和范旭宁。

专家点评

张晓宇，李劲松 （中国科学院院士）

类精子干细胞介导半克隆技术实现全新核型小鼠模型的构建

染色体的稳定与变化是个体生存和物种演化的基础，是遗传物质宏观调控规律的一体两面，染色体数目和结构的变异常常对个体造成不利影响，而新物种的形成往往又伴随复杂的染色体结构演化。如何研究高等生物的基因组结构组织规律？如何理解染色体结构变异在细胞和个体生命活动中的意义？如何解析染色体结构变异在生殖隔离建立以及物种演替中的做用？如何确定染色体变异疾病的产生、发展和传递的机制？这一系列的重要科学问题均需要科学家具有对生物尤其是高等哺乳动物的染色体进行遗传改造建模的能力，但是改造哺乳动物染色体在技术上面临极大的困难和挑战。

染色体的结构重组一方面为物种演化提供了原材料，另一方面也与诸多遗传疾病和后天疾病例如白血病有关。基于系统生物学研究，距今约3~4百万年前，人与黑猩猩的共同祖先内部产生了染色体结构上的分异，两条独立的染色体通过头对头（类似罗氏易位，Robertsonian translocation）方式融合成为现今现代人的二号染色体（HSA2），这一改变可能直接导致了人类始祖与黑猩猩始祖之间的生殖隔离，成为人类物种演化的关键性事件【6】。染色体融合是一种人类染色体结构变异中常见形式，平均1000名新生儿中就有1例罗氏易位病例，发病率高【7】。已有研究表明具有15号和21号染色体罗氏易位的新生儿患急性淋巴白血病的患病风险会提高2700倍【8】。此外，罗氏易位会造成配子质量下降，在减数分裂过程中产生紊乱，导致配子数目异常，最终产生唐氏综合症、Patau综合症等严重的出生缺陷【9】。

因此，可以说在单基因/多基因复杂遗传疾病均可以高效建模的今天，突破哺乳动物个体水平染色体遗传改造的技术瓶颈是遗传学家一项重要的科学使命。

2018年，中国科学家团队率先实现基于酵母的大规模染色体改造，成功将酵母染色体合并为一条，并研究了染色体重塑对酵母生理活动的影响（Nature突破丨中国学者创造单条融合染色体酵母——元英进、戴俊彪等解读）【10,11】。这一重大突破激发了科学家思考核内染色体空间组织模式在真核生物基因组稳态及生长发育中的作用。在更高级的哺乳动物层面上开展染色体改造的研究呼之欲出。

2022年8月26日，中科院动物所研究团队在Science上发表的这一原创性工作，一举将染色体结构人工遗传改造推高到哺乳动物个体水平，突破了人工编程化改造哺乳动物基因组的最大技术瓶颈。在本项研究中，研究人员基于小鼠参考基因组设计了特异性基因编辑方案，通过分别移除小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞（又可称为类精子干细胞）的两条端着丝粒染色体的端粒端和着丝粒端，将两条染色体融合在一起。研究人员发现了Chr1和Chr2首尾融合形成的超长染色体存在较强的有丝分裂异常，此外研究人员还巧妙地以Chr17染色体作为受体，对超长的融合染色体进行截短回补实验修复了超长染色体带来的有丝分裂异常，这暗示了小鼠染色体可能存在长度界限。类精子干细胞可以替代精子使卵母细胞“受精”产生半克隆小鼠的特性支持了染色体融合改造小鼠的一步构建【12,13】。本项研究中研究人员通过将染色体融合改造的类精子干细胞注射入卵母细胞，获得Chr4+5和Chr1+2两种类型的杂合半克隆小鼠，两类小鼠表现出行为和生殖能力上的差异，其中携带Chr4+5融合染色体的半克隆小鼠没有表现出明显的异常，并可以通过配子向下传递，获得了三只携带19对染色体的小鼠。这些结果暗示了染色体结构变异在个体行为上存在着深层次影响，同时，携带融合染色体的小鼠的建立，构建了从“新染色体”设计到“新物种”建立的技术路线。

值得一提的是，本项研究创造的新的染色体融合方式（首尾连接染色体）在自然界中尚未被发现，但这并不能排除在演化的历史长河中出现过类似的染色体首尾连接模式，然而，由于与有丝分裂和胚胎发育等生命活动不兼容而没有被保留下来。揭示物种演化过程中的频繁的基因组重组背后的逻辑以及其对应的演化意义是研究者们未来需要进一步深入思考的科学问题。

本项研究的发表，使得科学家进行染色体结构改造一步跃升到哺乳动物的个体层面，开启了以小鼠为代表的哺乳动物染色体遗传改造的新领域，同时也是“类精子干细胞”介导半克隆技术的一项新的颠覆性应用。染色体结构变异类型多样，除本文创造的染色体首尾融合方式，还包括染色体头对头融合模式的罗氏易位、染色体末端融合形成的环状染色体、染色体臂间倒位等多种染色体结构变异类型。其中环化染色体是人类中存在的一种罕见染色体结构变异遗传疾病，患者的染色体融合环化，产生一系列发育迟滞等疾病表征【14】。但是，由于缺乏手段，目前尚未有环化染色体疾病动物模型被成功建立。基于基因编辑工具和类精子干细胞技术，未来可以实现包括罗氏易位模型、环化染色体模型、臂间倒位模型等一系列个体水平的染色体改造，为研究物种演化和染色体异常遗传疾病等领域提供强有力支撑。

可以预见，类精子干细胞介导半克隆技术作为衔接细胞和个体的强有力遗传载体，未来在合成生物学和系统生物学的加持下会焕发的巨大活力。人工改造物种及人工定制物种成为可能，高等生物全基因组设计重排也不是幻想。或许未来某一天回顾科学发展历程，我们可以定义2022年为哺乳动物染色体尺度基因组重塑元年。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.abm1964

制版人：十一

参考文献

1. J. J. Yunis, O. Prakash, The origin of man: a chromosomal pictorial legacy. Science 215, 1525-1530 (1982).

2. J. Britton-Davidian et al., Rapid chromosomal evolution in island mice. Nature 403, 158 (2000).

3. L. H. Rieseberg, Chromosomal rearrangements and speciation. Trends Ecol Evol 16, 351-358 (2001).

4. Y. Shao et al., Creating a functional single-chromosome yeast. Nature 560, 331-335 (2018).

5. J. Luo, X. Sun, B. P. Cormack, J. D. Boeke, Karyotype engineering by chromosome fusion leads to reproductive isolation in yeast. Nature 560, 392-396 (2018).

6. Stankiewicz, P. One pedigree we all may have come from–did Adam and Eve have the chromosome 2 fusion? Molecular Cytogenetics 9, 1-5 (2016).

7. Haigis, K.M. & Dove, W.F. A Robertsonian translocation suppresses a somatic recombination pathway to loss of heterozygosity. Nature genetics 33, 33-39 (2003).

8. Li, Y. et al. Constitutional and somatic rearrangement of chromosome 21 in acute lymphoblastic leukaemia. Nature 508, 98-102 (2014).

9. Ferfouri, F. et al. The chromosomal risk in sperm from heterozygous Robertsonian translocation carriers is related to the sperm count and the translocation type. Fertility and sterility 96, 1337-1343 (2011).

10. Shao, Y. et al. Creating a functional single-chromosome yeast. Nature 560, 331-335 (2018).

11. Luo, J., Sun, X., Cormack, B.P. & Boeke, J.D. Karyotype engineering by chromosome fusion leads to reproductive isolation in yeast. Nature 560, 392-396 (2018).

12. Li, W. et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice. Nature 490, 407-411 (2012).

13. Yang, H. et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell 149, 605-617 (2012).

14. Guilherme, R.S. et al. Mechanisms of ring chromosome formation, ring instability and clinical consequences. 12, 1-7 (2011).

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