NSMB | 张萌/桂淼等合作揭示神经降压素受体的信号传导分子机制

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G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors, GPCRs）是最大的膜蛋白受体超级家族。通过与细胞外配体相互作用，GPCR将配体携带的信号传递到细胞内，并进一步通过与G蛋白相互作用从而激活相应的胞内信号通路，产生细胞应答，完成细胞信号转导。GPCR能够结合的胞外配体范围极广，包括气味，光，荷尔蒙，神经递质等，因此在众多生理过程中承担至关重要的作用，这也使得GPCR成为超过30%现代药物的作用靶点。

 

近年来，一系列GPCR-G蛋白复合物冷冻电镜结构相继得以解析，对于理解GPCR信号转导机制意义重大。然而，由于样品稳定性低，制备难度大，GPCR-G蛋白复合物结构研究通常需要添加额外的辅助因子稳定其构象，如抗体（antibody）、纳米抗体（nanobody）或单链抗体（scFv）。这些非原生辅助因子的存在往往会导致GPCR信号传导功能的大幅度降低甚至完全丧失。另外，绝大多数GPCR-G蛋白复合物样品使用去垢剂胶束（micelle）来模拟细胞环境，然而micelle难以复刻细胞原生环境中磷脂双层膜的厚度、弧度以及横向压力等特性。Micelle的使用可能是样品稳定性低的原因之一。

 

2016年，哈佛医学院的Gerhard Wagner教授研发了可闭合的纳米磷脂盘（circularizednanodisc, cND）【1】，该技术是传统nanodisc方法的改良版。cND能提供与体内细胞膜类似的磷脂双层膜环境，使得GPCR-G蛋白复合物在无额外辅助因子的情况下也能稳定存在，从而为结构解析奠定了基础。

图1. NTSR1-G蛋白复合物整合进cND示意图

 

2021年2月25日，哈佛医学院Gerhard Wagner团队的张萌博士与Alan Brown团队的桂淼博士合作对神经降压素受体（neurotensin receptor 1, NTSR1）的G蛋白信号传导机制进行了研究，并作为共同一作在Nature Structural & Molecular Biology发表了题为Cryo-EM structure of an activated GPCR–G protein complex in lipid nanodiscs的研究论文，首次在磷脂双层膜环境中解析了无额外辅助因子的GPCR-G蛋白复合物的高分辨率冷冻电镜结构，鉴定出了两种构象，通过与NTSR1-G蛋白复合物在micelle中结构的比较，揭示了NTSR1-G蛋白相比micelle中更加紧密的相互作用网络以及磷脂双层膜在信号传导中至关重要的作用，并基于此提出了NTSR1-G蛋白信号传导过程中GDP-GTP交换的别构机制。

 

本文的结论和亮点包括：

1. 首次使用分子相互作用分析技术，包括生物膜干涉技术(BLI)以及微量热泳动技术(MST)，对NTSR1和G蛋白的结合亲和力(Binding Affinity)进行直接测量，并发现cND中NTSR1-G蛋白亲和力高于micelle中20倍。同时，圆二色谱热稳定性试验显示cND中NTSR1-G蛋白稳定性高于micelle中近20ºC。揭示了磷脂双层膜在NTSR1-G蛋白结合中的重要作用以及未来相关研究中使用磷脂双层膜的必要性。

图2. NTSR1-G蛋白复合物结构以及G蛋白和磷脂相互作用

 

2. 通过结构分析发现,G蛋白与磷脂双层膜产生了静电相互作用以及疏水性相互作用，从而辅助了G蛋白与NTSR1的结合；同时，在磷脂双层膜的横向压力下NTSR1整体构象相比micelle中更加紧凑，由于Ga亚基的a5螺旋嵌入NTSR1核心深度不变，紧凑的构象使得NTSR1的第五螺旋 （TM5） 胞内段、第六螺旋 （TM6） 胞内段以及第三胞内环 （ICL3） 更加靠近a5从而产生了更强的NTSR1-G蛋白相互作用。通过分析NTSR1-G蛋白相互作用界面，发现多处在micelle中未发现的强相互作用，例如NTSR1中的K176, K178, S182, R185, 和E166氨基酸分别与G蛋白中的E28, A31, R32, 和C351氨基酸建立了氢键或盐桥，从而增强了NTSR1-G蛋白间的结合。通过分子动力学模拟发现NTSR1 ICL3与Ga亚基的a4b6产生强相互作用，从而参与调控了G蛋白以a5为轴相对NTSR1的旋转。

3. 通过对G蛋白中核苷酸结合袋结构变化的分析，发现更多此前未报道的结构单元参与GDP释放，包括Ga亚基的a螺旋结构域 （AHD） 与a1螺旋结构变化的偶联、a2螺旋上氨基酸E245侧链95º旋转、负责与核苷酸中的磷酸结合的P环 （P-loop） 由包裹状向舒展状变化等，揭示了GDP解离的既复杂又高效协作的别构调控机制。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41594-020-00554-6

制版人：琪酱

参考文献

1.Nasr,M. L. et al. Covalently circularized nanodiscs for studying membraneproteins and viral entry. Nat. Methods 14, 49–52 (2016).