Mol Cell | “合（和）为贵”——可爱龙实验室解析基于CRISPR-Cas3新系统的新机制与新应用

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CRISPR-Cas系统是原核生物一种抵御外来入侵核酸的免疫系统，已被广泛用于真核细胞的基因组编辑。目前基于CRISPR-Cas的基因编辑技术已广泛应用于遗传育种、新药开发、疾病治疗、动物模型构建、转录调控以及分子诊断等各领域。被誉为在后基因组时代开创了遗传疾病精准治疗的新时代。

CRISPR-Cas系统可以按照效应物是多亚基或单亚基分为Class I和Class II （一型和二型） 。单亚基效应物的Class II家族包括大家常用的Cas9, Cas12, Cas13等，因其简单、高效、普适性的特性，其应用早已风靡全世界实验室。如果从分布比例上看，多亚基类型的Class I家族才是CRISPR-Cas系统的“名门望族”，其占比超过75%，对比Cas9，Cas12，Cas13总和也不过10%左右，可谓呈“辗轧之势”。然而Class I家族CRISPR-Cas系统，因为多亚基特性，其样品的获取，操作的编辑性，功能、机制的研究等都显得相对难度更大，因此该家族的研究和应用一直滞后很多。

不过近些年，Class I家族引起低脱靶，低毒性，功能更丰富多彩的特性，正逐渐展现出特有的魅力 【1-7】 。不过Class I家族庞大，成员众多，同时每一亚类可能又展现不同的性质，因此对这一庞大家族的了解也不透彻。

2022年7月13日，康奈尔大学的可爱龙实验室在Molecular Cell上发表了文章  Allosteric control of type I-A CRISPR-Cas3 complexes and establishment as effective nucleic acid detection and human genome editing tools ， 报道了基于type I-A系统的CRISPR-Cas3新机制解析和新应用开发。

Type I系统大家普遍认知的工作机制是Cascade首先靶向目标DNA，形成full R-loop之后，再招募Cas3完成对靶标DNA的切割和水解。简而言之就是：“分—合—分”机制。然而胡纯一博士等人发现Type I-A 系统一个显著不同于type I其他系统的性质：Cas3与Cascade是形成一种内在的复合物，而不依赖于目标DNA靶向与否，简言之就是“合-合-合”。 （如下图所示）

分分合合与否，固然鲜明。然而CRISPR系统最重要的一项性质就是：该系统如何去避免脱靶效应，从而降低非特异性的切割？其他的Type I系统利用Cas3的招募与否来规避脱靶效应 （非特异性的靶向不能招募Cas3） 。因此，Cas3一直结合在Cascade上的type I-A系统又是如何去规避这一难点？

康奈尔大学可爱龙实验室胡纯一博士联合瑞士洛桑大学/瑞士联邦理工学院Henning Stahlberg实验室倪冬春博士等人，使用冷冻电镜全面解析了type I-A 系统九种状态下的全景工作机制。这些捕获的工作状态桥段，确切的表面，Cas3通过与Cas8的互作，从而成为Cascade的内在一部分，并且Cas3通过稳定Cas8的N端构象，极大的促进了PAM识别和DNA靶向，该结果表面Cas3的内在性是具有积极和重要作用的。重要的是，他们发现，type I-A Cascade结合DNA形成完全互补配对的full R-loop结构之后，通过层层构象变化，最终传递给Cas3产生一个巨大的构象改变，暴露核酸酶活性中心，从而开始切割靶向DNA。而部分结合 （非特异性结合） 靶标形成的partial R-loop结构不能产生这种刺激，Cas3核酸酶依然保持抑制状态，从而避免脱靶切割 （如下图） 。

众云“合 （和） 为贵”，那么这套type I-A系统独特的吸引力在哪里？胡纯一博士等人发现，type I-A 内在式的Cascade-Cas3复合物在不结合目标DNA时，完全没有任何核酸酶性质，而当有正确的靶标出现，激活Cas3活性之后，会产生一个附属活性，从而可以对FQ-ssDNA探针 （荧光-淬灭-单链DNA探针） 进行切割，产生荧光，因此可以通过荧光的强弱即可判断是否有目标DNA。团队以此原理，开发了一套高效快速的核酸分子诊断工具，并命名为“HASTE” (heat-activated streamlined nucleic acid detection platform) 。据报道，该系统可以在15分钟之内，对单分子量级的DNA完成检测，效果显著，有着与传统PCR一样可靠的精度，却极大缩短了时间和成本 （下图） 。

有意思的是，该项工作还发现，这个I-A系统Cas3的解旋酶活性严格依赖温度，温度越高，活性越强。因此可爱龙团队利用42度温度刺激，可以开发一套温控基因敲除工具，效率超过90%。因此，在未来，可以利用该性质，未来可以在病灶通过局部的温度刺激来调控该工具的基因编辑效率，从而最大限度地降低基因编辑工具带来的脱靶效应。

可爱龙教授早年毕业于中国科技大学，目前于康奈尔大学任教授，获Robert J. Appel Professor荣誉头衔。主攻RNA相关领域的分子机制，包括核酶（Ribozyme）和CRISPR-Cas。在这两个领域都取得了十分喜人的成绩，最近六年发表Nature, Science, Cell论文十余篇。据悉，可爱龙实验室目前还有三个博士后名额，分别为生物信息学，细胞生物和结构生物学方向各一名。

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原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.06.007

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参考文献

1. Dolan, A.E., Hou, Z., Xiao, Y., Gramelspacher, M.J., Heo, J., Howden, S.E., Freddolino, P.L., Ke, A. and Zhang, Y. (2019) Introducing a Spectrum of Long-Range Genomic Deletions in Human Embryonic Stem Cells Using Type I CRISPR-Cas. Molecular cell, 74, 936-950 e935.

2. Tan, R., Krueger, R.K., Gramelspacher, M.J., Zhou, X., Xiao, Y., Ke, A., Hou, Z. and Zhang, Y. (2022) Cas11 enables genome engineering in human cells with compact CRISPR-Cas3 systems. Molecular cell, 82, 852-867 e855.

3. Morisaka, H., Yoshimi, K., Okuzaki, Y., Gee, P., Kunihiro, Y., Sonpho, E., Xu, H., Sasakawa, N., Naito, Y., Nakada, S. et al. (2019) CRISPR-Cas3 induces broad and unidirectional genome editing in human cells. Nature communications, 10, 5302.

4. Cameron, P., Coons, M.M., Klompe, S.E., Lied, A.M., Smith, S.C., Vidal, B., Donohoue, P.D., Rotstein, T., Kohrs, B.W., Nyer, D.B. et al. (2019) Harnessing type I CRISPR-Cas systems for genome engineering in human cells. Nature biotechnology, 37, 1471-1477.

5. Ozcan, A., Krajeski, R., Ioannidi, E., Lee, B., Gardner, A., Makarova, K.S., Koonin, E.V., Abudayyeh, O.O. and Gootenberg, J.S. (2021) Programmable RNA targeting with the single-protein CRISPR effector Cas7-11. Nature, 597, 720-725.

6. van Beljouw, S.P.B., Haagsma, A.C., Rodriguez-Molina, A., van den Berg, D.F., Vink, J.N.A. and Brouns, S.J.J. (2021) The gRAMP CRISPR-Cas effector is an RNA endonuclease complexed with a caspase-like peptidase. Science, 373, 1349-1353.

7. You, L., Ma, J., Wang, J., Artamonova, D., Wang, M., Liu, L., Xiang, H., Severinov, K., Zhang, X. and Wang, Y. (2019) Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference. Cell, 176, 239-253 e216.

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