NBT︱NeoScreen：对肿瘤（新）抗原进行高度敏感筛选的新方法

撰文 | 咸姐

责编 | 兮

人类免疫系统能够识别并消除表达外源性非自身抗原的细胞，而所有恶性肿瘤都存在非同义突变或其他基因改变，其中一些可能产生新的“非自身”表位，从而可能触发机体的抗肿瘤T细胞反应。近年来，肿瘤免疫疗法已成为继手术、放疗和化疗之后的重要肿瘤治疗手段。基于治疗性疫苗或转导靶向肿瘤新抗原的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的癌症免疫疗法已显示出良好的临床效果【1,2】。此外，带有肿瘤反应性T细胞受体（TCR）的血液T细胞工程的发展也进一步扩大了过继性T细胞治疗（ACT）的范畴【3,4】。可以想见，临床相关肿瘤抗原及其同源TCR的鉴定是此类治疗的重要基础。

目前，体外扩增的自体TIL或外周血淋巴细胞（PBL）通常用于肿瘤抗原的发现。然而，PBL和TIL中新抗原特异性T细胞的频率通常较低，而且已有研究证实PBL和TIL中新抗原是不一致的。此外，尽管在改进血液中新抗原反应性的检测方面有一些开创性的工作，但是不容否认的是PBL中的抗原发现仍然具有巨大挑战性。而TIL虽然有其优越性，但是传统的体外TIL扩增培养方法已被证明存在扭曲性，因此肿瘤反应性淋巴细胞的数量可能被低估了，并且也可能限制了肿瘤表位的验证。

2021年11月15日，来自瑞士洛桑大学的Alexandre Harari团队在Nature Biotechnology上在线发表题为Sensitive identification of neoantigens and cognate TCRs in human solid tumors 的文章，开发了一种能够敏感识别罕见肿瘤（新）抗原和肿瘤浸润淋巴细胞表达的同源TCR的方法——NeoScreen，并且证实通过NeoScreen鉴定得到的肿瘤抗原特异性TCR转导的T细胞介导了患者来源的异种移植小鼠肿瘤的消退。

与单纯依赖于生长因子白细胞介素(IL)-2的传统培养方法不同，NeoScreen是基于将来源于完整肿瘤碎片或分离的肿瘤细胞的TIL早期暴露于装载在活性自体抗原提呈细胞（APC）上的选择性抗原中（图1）。本研究选择的APC是CD40激活的（CD40-act）B细胞，因为相对于树突状细胞而言，它们更容易从少量血液中获得和扩增，并且易于通过电穿孔进行工程化。同时，为了优化APC效力，研究人员通过共电穿孔RNA编码的免疫刺激性4-1BB配体（4-1BBL/CD137）、OX40配体（OX40L/CD252）和IL-12 对CD40-act B细胞进行了改造。

研究人员首先通过利用来自两个肿瘤标本的TIL验证了NeoScreen方法的功能。传统的IL-2扩增TIL的方法可以很容易的识别此两个标本中的四种新表位反应，但与之相比，暴露于自体工程化APC的TIL中的新表位特异性CD8 T细胞的频率显著增加。

随后，研究人员在另外7名患者中测试了NeoScreen发现新肿瘤抗原的能力。研究人员应用蛋白质基因组学NeoDisc进行预测，利用基于免疫肽组学的新抗原识别和优先排序，且仅关注非同义体细胞点突变和肿瘤相关抗原（TAA）候选物。在TIL刺激期间添加一次（1×）或两次（2×）装载了新抗原和/或TAA候选物的工程化自体APC，并将NeoScreen扩增的TIL与传统培养的TIL进行比较，以确定是否存在抗原特异性细胞（图1）。结果显示，NeoScreen能够在7名患者中识别19个肿瘤表位，其中10个表位仅在NeoScreen扩增的TIL中被发现。使用NeoScreen时，每个患者的平均肿瘤表位数为3个，而传统方法下仅为1个。

图1

通过NeoScreen，利用IFNγ酶联免疫斑点（ELISpot）、pMHC多聚体和4-1BB染色，研究人员累计验证了23种肿瘤抗原，包括15种新表位。与传统的TIL培养方法相比，NeoScreen TIL对于新表位或TAA反应的细胞的显著富集达到了几个数量级的差别。值得注意的是，当只考虑新抗原时，NeoScreen仍然明显优于传统策略。总的来说，在肿瘤抗原存在的情况下，工程化APC使新抗原（和TAA）特异性CD8 T细胞在黑色素瘤和卵巢癌、肺癌和结肠癌中大量扩增，从而建立了一种高度敏感和可重复的肿瘤抗原识别方法。

进一步地，研究人员推测，这个新的平台将能够灵敏地分离针对个性化肿瘤抗原的相关TCR。研究人员利用pMHC多聚体或4-1BB的上调纯化肿瘤抗原特异性的NeoScreen TIL，并对分离的T细胞进行TCRα和TCRβ批量测序。单个肿瘤表位由一个或多个克隆型识别，在NeoScreen TIL中以不同的频率出现。通过追踪原始肿瘤和NeoScreen扩增的TIL中经验证的TCRβ序列，研究人员确定了NeoScreen过程确实导致了肿瘤抗原特异性TIL的显著扩增。而50个克隆型的累积数据证实了NeoScreen识别新抗原或TAA特异性新TCR的潜力，这些新抗原或TAA在传统方法的TIL中未检测到。

最后，研究人员建立了自体肿瘤细胞系，对NeoScreen揭示的经验证的肿瘤抗原特异性TCR的抗肿瘤反应性进行了研究。所有NeoScreen来源的针对新表位或TAA的TCR都具有肿瘤反应性，值得一提的是，这是首次广泛证明了新抗原特异性TCR始终以自体肿瘤为靶点。那么NeoScreen识别的TCR是否可用于个性化的基于TCR的ACT呢？答案是可喜的。在人IL-2转基因（hIL-2）NOG小鼠模型中使用患者来源的异种移植肿瘤，研究人员发现过继移植转导了来自NeoScreen TIL的肿瘤抗原特异性TCR的外周血T细胞介导了体内肿瘤的特异性消退（图2）。由此证实通过NeoScreen鉴定的抗原特异性TCR在体外和体内均具有抗肿瘤反应性，证明NeoScreen用于TCR基因转导治疗具有可行性。

图2

综上所述，本研究首次在TIL生长的起始阶段使用工程化B细胞来提高抗原发现的敏感性，研发了一种能够对肿瘤（新）抗原进行高度敏感筛选的方法——NeoScreen，该方法能产生迄今为止最广泛的肿瘤抗原反应性TCR。NeoScreen不仅可以增加传统方法所发现的抗原特异性TCR的频率，而且还可以招募额外的TCR克隆型，并以显著提高的敏感性被新检测出来。NeoScreen能够高效识别黑色素瘤以及卵巢癌、结直肠癌和肺癌中的肿瘤特异性抗原，并且能够高度敏感地分离同源肿瘤反应性TCR。由此也显示，NeoScreen对于为肿瘤疫苗选择相关的个性化靶抗原，以及为实体瘤的个性化工程T细胞治疗分离肿瘤反应性TCR都具有不可忽视的价值意义。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41587-021-01072-6

制版人：十一

参考文献

1. Tran, E. et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science 344, 642–644 (2014).

2. Chen, F. et al. Neoantigen identification strategies enable personalized immunotherapy in refractory solid tumors. J. Clin. Invest. 129, 2056–2070 (2019).

3. Sadelain, M., Rivière, I. & Riddell, S. Therapeutic T cell engineering. Nature 545, 423–431 (2017).

4. Rosenberg, S. A. & Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science 348, 62–68 (2015).

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