徐天宏点评 | “第三代基因编辑+AI”能碰撞出怎样的火花？

目前，先导编辑（Prime Editing）的优化主要有两个方面，一是采用工程化改造技术，实现先导编辑蛋白的小型化、多元化；二是利用Prime Editing涉及到的修复通路，改造蛋白。另外，提高pegRNA的稳定性也很重要。

——贝斯生物 徐天宏

Prime Editing是2019年David Liu课题组开发的第三代基因编辑技术，它可以在不断裂双链DNA的情况下，实现基因组DNA特定碱基的替换、插入和删除[1]。与其他CRISPR-Cas衍生的基因组编辑工具（包括CRISPR核酸酶和Base Editor）相比，Prime Editing具有编辑范围广、脱靶效应低等优点，因此在人类罕见病治疗等领域有更广阔的应用前景。

Prime Editing的作用机制包括4个步骤：1）Prime editor复合物启动靶DNA搜索；2）Prime editor复合物找到携带目标突变的DNA，并使其中一条链产生缺口；3）被切割的DNA链启用逆转录酶域（RT domain）以进行DNA合成；4）Prime editor复合物替换正确的DNA序列。（来源：Prime官网）

Prime Editor系统的核心包括效应蛋白和pegRNA两部分。效应蛋白是逆转录酶与具有单链切割活性的Cas9n的融合蛋白；pegRNA是在sgRNA的基础上，对其3′端进行延长，增加逆转录模板（reverse transcriptase templates, RTT）和引物结合位点（primer binding site, PBS）。RTT序列携带人为设计的遗传信息，而PBS序列是逆转录引物的结合位点。pegRNA包括一个与目标序列同源的引物结合位点，以及一个包含预期编辑的逆转录酶模板，所有这些都位于标准CRISPR-Cas9引导RNA的3'延伸段中。

在目标位点，Cas9切割基因组DNA的一条链，然后退火到pegRNA上的引物结合位点，并由Cas9融合的逆转录酶使用pegRNA编码的模板序列进行扩展。接下来，DNA修复机制解决了两条DNA链上冲突的序列，最终将预期的编辑写入基因组。

CBE, ABE及Prime Editor示意图（来源：MedComm）[2]

CRISPR-Cas9被比作能够破坏目的基因的“分子剪刀”，Base Editor（CBE和ABE）被视为能够替代单核苷酸的“分子铅笔”，Prime Editing可以比喻为“分子文字处理器”，它能够直接在基因组上执行搜索和替换操作。与其他基因组编辑工具相比，Prime Editing拥有更广泛的应用范围、更好的编辑精度和安全性，且副产物很少。

但是，在蛋白质翻译过程中，密码子是3个核苷酸的组合，不同的密码子可以在蛋白质中编码相同的氨基酸，所以通过基因编辑来获得蛋白质水平上相同的结果，其实有数百种不同的方法。

在这种情况下，如何提高序列插入成功率、减少Prime Editing过程中的试错成本成为了科学家们的研究重点。

近日发表在Nature Biotechnology杂志的一篇论文显示，英国Wellcome Sanger研究所的研究人员使用Prime Editing评估了数千个DNA序列插入基因组的成功率。然后用这些数据训练机器学习算法，来预测将基因编辑的DNA序列成功插入细胞基因组的概率，以帮助研究人员为给定的遗传缺陷设计最佳修复方案。

来源：Nature Biotechnology[3]

在这项研究中，科学家们设计了3604个DNA序列，长1–69个DNA碱基。这些序列插入到3种不同的人类细胞系中，在不同的DNA修复环境中使用不同的Prime Editing递送系统。一周后，对细胞进行基因组测序，检查编辑是否成功。

研究人员评估了每个序列的插入成功率，以确定每次编辑成功的共同因素，结果发现，插入序列长度、核苷酸组成和二级结构都会影响插入效率，另外，所涉及的DNA修复机制类型也是影响插入效率的关键因素。

此外，研究人员定义了错配修复（mismatch repair，MMR）对插入序列的精确影响，并发现3' flap核酸酶TREX1和TREX2的过表达阻止了长序列的插入。总之，序列特征和修复通路活性很大程度上影响了插入成功率。

最后，研究人员使用这些数据训练了一个基于序列的预测模型，该模型能够高精度地预测新序列的编辑结果，帮助研究人员确定遗传缺陷的最佳修复方法。

该团队的下一步计划是为所有已知的人类遗传疾病制作模型，以便更好地了解是否及如何使用Prime Editing来修复这些疾病。

专家点评

贝斯生物 创始人 徐天宏博士

徐天宏博士，毕业于复旦大学，临床医生，美国贝勒医学院分子和人类遗传学博士。主要科研成果包括世界上第一个发现了一种重要的遗传性心脏病ARVC的最主要致病基因PKP2。在生物医学领域具有20年临床医生、科研、创业和风险投资经验，拥有多项生物技术的发明专利，于2021年4月正式创立贝斯生物，公司专注于研发新型基因编辑NK细胞治疗产品及遗传病治疗产品。

医药魔方Pro：首先能否请您点评一下项发表在Nature Biotechnology杂志上的新成果？

徐天宏博士:发表在Nature Biotechnology上面的这篇文章主要分析了利用Prime Editing编辑的影响因素。他们设计了3604条不同类型的pegRNA，在3种细胞系中检测了编辑效率，通过分析插入长度、GC含量、二级结构等条件，总结出了影响编辑效率的因素。最后，文章基于已有数据开发了一个预测软件（网页版链接：https://doc.pharmcube.com/image476f0b89b54a4e6c862f158c268b428d），方便大家使用。值得注意的是，文章只用了4个靶点进行编辑研究，同时，也只是在细胞系中开展，相关的结论还需要在更多位点以及更多类型细胞，比如原代细胞中验证。总的来说，文章系统研究了Prime Editing的编辑过程与效果，让大家对这种编辑技术有了更深的认识，为以后更加精确高效利用此工具提供了有力支持。

医药魔方Pro：与碱基编辑相比，先导编辑（Prime Editing）技术的潜在优势有哪些？

徐天宏博士:碱基编辑是利用脱氨酶对胞嘧啶或者腺嘌呤脱氨实现点突变，目前主要是实现C到T以及A到G的转换，对于其他类型的点突变无法实现，或效率以及纯度不够。先导编辑作用原理不同，该系统是在逆转录酶的作用下，利用pegRNA上携带的突变，将突变通过反转录形式整合到基因组上，理论上可以实现任何类型的点突变，同时还可以实现短片段的插入。

医药魔方Pro：现阶段的先导编辑（Prime Editing）技术还有哪些需要优化的地方？有哪些潜在的优化途径？

徐天宏博士:先导编辑技术存在编辑效率低，编辑器比较大等问题。优化的方面主要是两个，一个是先导编辑蛋白，即将逆转录酶与Cas9融合形成的融合蛋白。针对这个融合蛋白，目前存在的问题是蛋白比较大，需要开发小型的融合蛋白。第二个是对于pegRNA的优化。PBS序列对于Prime Editing的编辑至关重要，但是也存在容易降解以及与spacer序列配对的问题。针对上述问题，一是采用工程化改造技术，实现先导编辑蛋白的小型化、多元化。二是利用Prime Editing涉及到的修复通路，改造蛋白。另外，提高pegRNA的稳定性也很重要。

医药魔方Pro：最新的融资新闻稿称，贝斯生物开发了目前编辑效率最高的先导编辑（Prime Editing）技术。这种高编辑效率是如何实现的？

徐天宏博士:如前所述，影响先导编辑效率的一个是融合蛋白，第二个是pegRNA。贝斯生物基于Prime Editing的原理，提出了稳定pegRNA的策略，这种策略不仅改造了pegRNA，同时改造了融合蛋白。为此贝斯生物提出了ePE编辑系统，显著提高了编辑效率，是目前行业内领先的先导编辑工具。

医药魔方Pro：贝斯生物基于碱基编辑和先导编辑（Prime Editing）布局了怎样的管线？能否介绍1–2个代表性项目？

徐天宏博士:贝斯生物关注于碱基编辑和先导编辑的底层创新。技术的改造与优化，一直是我们的研发重点，目前我们也搭建了较完善的平台。前期，我们证明了我们的碱基编辑工具与先导编辑工具的高效性和安全性，因此在细胞治疗与基因治疗领域均有所布局。

代表性的项目一个是将我们的编辑工具与免疫细胞结合，开发了NK510项目，目前已经开展了IIT试验。另外在基因治疗领域，我们也开发了高效的递送系统，临床前研究已经初步得到了好的效果。

医药魔方Pro：未来3–5年，碱基编辑和先导编辑（Prime Editing）领域会取得怎样的突破？您给贝斯生物制定了怎样的发展目标？

徐天宏博士:领域的发展依赖于先进的技术。对于碱基编辑和先导编辑，编辑效率目前已经达到了很高的水平。贝斯生物利用具有自己知识产权的碱基编辑工具，已经在原代细胞上实现了高达95%的编辑效率，且安全性也有保证。如何更好的利用该工具，实现细胞与基因治疗，造福更多患者，是贝斯生物、也是行业共同努力的方向。我认为未来，行业会开发更多高效的递送手段，实现in vitro 和in vivo的高效编辑，推动细胞与基因治疗的蓬勃发展。

贝斯生物以治愈疾病为出发点，一方面我们将继续深耕基因编辑工具，开发出更多高效的工具；另一方面，我们也将大力推进碱基编辑和先导编辑相关治疗产品的临床试验，争取实现1–2个产品的上市，让更多患者用上更廉价、更有效的药物。

参考资料：

[1]Andrew V Anzalone et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature（2019）

[2]Weilin Zhou et al. Current landscape of gene-editing technology in biomedicine: Applications, advantages, challenges, and perspectives. MedComm（2020）

[3]Jonas Koeppel et al.Prediction of prime editing insertion efficiencies using sequence features and DNA repair determinants. Nature Biotechnology（2023）