Cell | 赵宏图等揭示⍺溶血素分泌系统组装和底物识别转运的分子机制

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1型分泌系统 (Type I Secretion System, T1SS ) 是在致病性革兰氏阴性细菌中广泛存在的一类蛋白转运系统，负责向细胞周围环境分泌种类繁多的毒力因子。相较于其他类型的细菌分泌系统，它结构组成相对简单，但是却可以高效的转运包括毒素蛋白、蛋白酶和粘附素等各种类型的底物分子，是革兰氏阴性菌中一种重要的的毒力系统。⍺溶血素分泌系统 （hemolysin A secretion system） 作为第一个被鉴定出的1型分泌系统，在过去三四十年中一直被作为研究1型分泌系统的模式系统。此前的研究发现，⍺溶血素分泌系统由三种膜蛋白组成，包括细胞内膜上的ABC转运蛋白 （ATP-Binding Cassette Transporter） HlyB和膜融合蛋白 （membrane fusion protein） HlyD以及位于细胞外膜上的孔道蛋白TolC，其中HlyB和HlyD形成内膜复合物。⍺溶血素 （hemolysin A, HlyA ） 作为一个由超过1000个氨基酸残基组成的巨大底物分子，其多肽链在翻译完成之后，位于C端的蛋白分泌信号首先被内膜复合物HlyB/D识别，之后HlyA在未折叠的状态下通过由HlyB/D和TolC 共同形成的转运通道分泌至细胞外，并且在钙离子结合等因素下完成折叠，逐步形成具有裂解血红细胞能力的毒素分子。长期以来，虽然人们对于HlyA的分泌过程有了大致的了解，但是由于缺乏准确的结构信息，对于该分泌系统如何组装以及底物如何被识别的分子机制还知之甚少，这也在很大程度上阻碍了对其进行针对性抑制和干预的研究。

2022年9月1日，来自洛克菲勒大学的陈珏教授实验室在Cell上发表了题为 The hemolysin A secretion system is a multi-engine pump containing three ABC transporters 的研究论文 （共同第一作者是赵宏图和James Lee） ， 对⍺溶血素分泌系统内膜复合物HlyB/D的组装和⍺溶血素HlyA识别转运的机制进行了阐释。

在本研究中，作者首先克服了HlyB/D复合物性质不稳定和相互作用较弱等困难，通过不断的尝试和优化蛋白表达纯化条件，获得了生化性质均一的样品并最终利用单颗粒冷冻电镜技术解析了HlyB/D复合物的高分辨率结构 （图1） 。基于以往对ABC转运蛋白家族的研究和认识，此前人们普遍认为在复合物中HlyB会以经典的单个同源二聚体的形式存在，而争论的焦点在于HlyD是形成三聚体还是六聚体，即HlyB和HlyD可能以2:3或者2:6的比例来形成复合物。然而令人惊讶的是，结构显示HlyB/D复合物由三个不对称的结构原聚体 （protomer） 组成，而每个原聚体中均包括一个HlyB同源二聚体 （homodimer） 和两个HlyD单体 （monomer） 分子，即HlyB和HlyD实际上是以6:6的比例形成了一个异十二聚体 （hetero-dodecamer） ，这也回答了该领域内长期对于HlyB/D复合物组装形式和化学计量比的疑问。有意思的是，作为ABC转运蛋白家族的成员，HlyB在复合物中虽然没有结合底物和ATP分子，却同时呈现出向内开放 （inward-facing） 和封闭 （occluded） 的两种构象状态 （图2） ，这也提示在底物溶血素HlyA识别和转运的过程中，三个HlyB二聚体在同一时间可能发挥着不同的功能。

图1.  ⍺溶血素分泌系统内膜复合物HlyB/D的高分辨率结构

图2.  ABC转运蛋白HlyB在复合物中同时呈现的两种构象状态

此外，作者还分析了HlyB/D复合物形成多聚体的结构基础，发现三个结构原聚体主要是通过胞质侧相邻原聚体之间的盐键相互作用而形成完整的复合物结构，而且该相互作用界面在相关的1型分泌系统中高度保守。随后作者通过大量的生化和功能实验证实这种多聚体结构对于溶血素HlyA的分泌是必需的，验证了结构和功能的相关性。

进一步地，为了研究HlyB/D复合物结合和催化水解ATP的特性，作者分别对纯化的HlyB/D复合物和HlyB二聚体的ATPase活性进行了测定和比较，同时还解析了HlyB/D复合物在结合ATP状态下的高分辨率冷冻电镜结构，并分析了ATP结合所引发的复合物构象变化。另外，作者还通过结构分析和体内光交联实验证实，虽然HlyB/D复合物中形成了明显的中央孔道，为底物转运提供了另一种可能的途径，但是底物溶血素HlyA的转运路径仍然是通过HlyB二聚体内部的空腔来进行。

基于上述研究，作者最后提出了⍺溶血素分泌系统新的可能的工作模型 （图3） ，即三个HlyB二聚体中，一个负责识别和转运底物，另外两个则负责催化水解ATP提供能量，在识别和装载底物HlyA后，膜融合蛋白HlyD发生相应的构象变化，进而和外膜蛋白TolC形成连续的孔道并将溶血素蛋白迅速有效地分泌至细胞外。

图3.  ⍺溶血素分泌系统新的工作模型

总的来说， 这项研究通过结构生物学和生物化学的手段对⍺溶血素分泌系统进行了较为系统的研究，首次揭示了其内膜复合物组装的结构基础，并获得了大量有关底物如何识别和转运的细节，也为今后有关1型分泌系统的研究提供了重要的依据和线索。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.07.017

制版人：十一

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