推进用于细胞和基因治疗产品开发的检测设备

介绍

分析方法在细胞和基因治疗行业中发挥着关键作用，因为它的规模不断扩大，产品组合的多样性和复杂性不断增加，并用于治疗各种疾病。分析方法对于研发(R&D)的所有阶段以及制造和上市后监控都很重要。因此，重要的是建立一个包括测量创新、标准和平台以及测量保证策略和支持技术的测量基础架构，以实现产品开发各个阶段所需的关键决策。

人们普遍认为，产品许可需要经过验证的分析方法或测定，并且从概念上讲，随着产品开发向上市进行，应采取具体步骤进行验证。但是，针对给定产品进行分析开发的确切方法可能会有很大差异。在这里，我们考虑通过：(1)协调良好的产品和分析方法开发工作以及(2)建立稳健的测量基础设施来简化分析方法开发的方法。

协调产品开发和分析方法开发

关键质量属性(CQA)是确保给定产品的质量、一致性、安全性和有效性的属性，并且理想地与预期的临床结果和作用机制(MOA)相关。从更大的属性集中选择CQA需要一个强大的表征程序，该程序由广泛的高质量分析方法组成（图 1）。

给定产品的 CQA（例如，身份、纯度、效力等）是基于全面的研发以及临床前和临床数据建立的。在临床结果证实之前，通常无法确认给定质量属性的关键性质，尤其是与效力相关的那些。鉴于产品类型的复杂性和适应症的范围，可以使用基于风险的方法来指导计划，以确保要评估的属性列表是可管理的和有意义的[1]。用于评估CQA的分析方法应在产品开发生命周期中不断完善和改进[2]。对给定细胞和基因治疗产品的质量属性的表征采用已被证实适合用途的分析方法进行，即为预期的测量目的提供有意义的读数，并最终在后期阶段得到验证产品开发（图 1）。

图 1. 协调的产品和分析方法开发。

在产品开发过程的早期，对更大的属性集进行更全面的表征，包括使用更复杂的仪器和方法（例如，多组学分析、多路流式细胞术分析、基于细胞的分析方法）获得的属性，有助于建立关于产品，优化制造流程，并MOA带来新的见解。由于缺乏适当的参考材料和某些分析方法的尖端性质，在早期表征过程中评估分析方法质量通常具有挑战性。此外，通常使用手动操作，例如复杂的样本处理或手动数据分析（例如，峰值拟合、门控或图像阈值处理）。这些分析方法的复杂性使得很难设想过渡到释放分析。相反，先进的测量能力和测量创新可以提供对与产品MOA相关或与制造过程控制相关的特定被测量的洞察力。基于这些数据，可以识别与产品质量和一致性相关的质量属性，并且可以开发更直接、简单和自动化的分析方法，并在产品制造或发布测试中为验证和常规使用提供清晰的路径。

如前所述，分析方法应符合目的，包括满足所需的性能标准（即选择性、灵敏度、精密度、准确度、稳健性、范围）[5]。在实践中，细胞和基因疗法的分析方法通常是复杂的、高度可变的并且难以验证。鉴于可用于给定被测量的大量分析方法[6]，挑战通常始于分析方法的选择；此外，每种方法在分析方法要求、样本量、样本制备步骤、试剂、时间/成本和/或监管限制方面都有其自身的优势和局限性。因此，重要的是为分析策略制定一个稳健的计划，该计划可以随着产品开发而逐步推进，并且可以经过验证以过渡以用于制造过程监控和发布测试。

可以在分析开发过程的早期做出努力，以帮助方法在产品开发阶段的过渡。对数据质量和解释的信心在研发阶段与后期一样重要。因此，应考虑纳入适当的测量控制和使用适当的实验设计和统计方法。由于质量属性被证明可以提供关键信息，因此应考虑将分析方法转变为自动化和GMP合规性。采用特定于测量的标准（例如，细胞计数、活力、滴度）或测量平台（例如，流式细胞术、PCR、NGS、显微镜）并在流程早期采用最佳实践也很重要。其他考虑因素包括试剂质量和采购。如果分析试剂不能始终如一地获得，或者分析方法对试剂性质或质量的微小变化很敏感，那么在试剂批次之间桥接分析方法时可能会遇到挑战。最近发布了一系列标准，从材料供应商和材料用户的角度解决辅助或原材料问题[3,4]。

分析发展面临的另一个挑战是，即使对于相似的被测量，不同的分析方法也会导致不同的结果。分析方法结果的差异可能源于分析方法的差异或生物反应的实际差异[7]。对于复杂的生物测定，分析方法的差异可能大到足以掩盖由于生物反应引起的任何差异。应实施测量保证策略以最小化和/或控制各种可变性来源[8]。对于产品放行，分析方法必须经过认证或验证，以证明其适用于预期测量。虽然在研发和临床试验的早期阶段不需要经过验证的分析方法，但强烈建议分析方法提供足够的测量信心。

分析方法设计的系统方法，有时称为分析质量设计(aQbD)，有助于满足特定的测量目标[2]，尤其是在探索阶段。该方法可以包括确定特定的测量目标、分析方法选择和鉴定、减少测量变异性的来源、定义设计空间以确保对分析方法、控制策略的信心，以及持续改进以提高方法的稳健性和对分析的理解方法设计空间[2]。

分析方法开发过程的探索阶段应该是迭代的，包括基于经验教训的持续改进和从产品开发的不同阶段收集的数据量的增加[9,10]。产品开发阶段（即发现、临床前、临床、监管审查和上市后监测）最终旨在建立大量证据来支持治疗的安全性和有效性。理想情况下，适当的分析工具、平台和标准可随时用于这一艰巨的产品开发过程。最终，该行业需要经过验证的分析方法来进行制造控制和产品放行。由于分析方法应使用代表最终产品的样品进行验证，因此在产品开发的后期阶段通常很难得出经过验证的分析方法。

另一方面，细胞和基因疗法有时会采用压缩的临床试验时间表，以便尽早获得经过验证的分析方法，并避免产品开发过程中不必要的延误[9]。进行分析方法验证以确认分析方法适用于其预期目的并满足某些性能标准[5]。随着产品开发过程中产生的数据越来越多，随着时间的推移收集的数据主体可以支持验证和性能标准的建立。

分析方法开发始于对各种分析方法的鉴定，这些分析方法稳步推进验证，同时还考虑正在进行的分析方法验证[1]。如前所述，应尽可能减少方法中的可变性。在持续的基础上，支持分析方法开发的基本原理应考虑正在开发的分析方法与其如何评估治疗产品的预期质量属性之间的关系。这个迭代过程应该会增加对测量质量属性的分析方法性能的理解，并最终导致开发适合制造和放行测试的分析方法[1]（图 1）。该过程还应生成了解产品异质性所需的关键数据，例如细胞治疗产品的供体变异性和制造过程的变异性。

方法设计支持更简化的分析方法开发的测量设备

鉴于分析开发的复杂性，我们设想开发一个强大的测量基础设施，以在产品开发的所有阶段支持不断发展的行业。这将包括通用测量保证策略、许多具有充分理解的能力和限制的测量平台、标准（文档和参考材料）以支持对特定应用程序/产品的给定测量平台进行快速验证，以及支持工具和简化和集成各种流程和数据的技术。

测量平台

鉴于可用分析工具的选择范围很广，并且给定质量属性（样品类型或量化的可用性、时间、成本等）的不同限制，选择合适的分析方法通常具有挑战性。从一种仪器转换到另一种仪器可以具有惊人的挑战性，可能需要额外的测量解决方案。例如，在没有参考品/对照的情况下，从手动细胞计数设备过渡到自动细胞计数设备并不简单[11]。另一个例子是来自不同供应商的流式细胞仪具有不同的激光器，这使得在没有额外策略的情况下很难进行直接比较。

为了更快地使用和采用测量平台，包括PCR、NGS、基因组编辑、流式细胞术以及细胞计数、活力和功能的分析方法，已经做出了许多努力。进一步促进建立衡量平台的一项战略是制定标准和最佳实践。为了收集必要的数据来为最佳实践的发展提供信息并确定和解决持续改进的领域，美国国家标准与技术研究院(NIST)启动了几个联盟（即基因组编辑、快速微生物检测方法和流式细胞术），这意味着促进工业界、学术界和政府专家之间的合作，以推进竞争前的测量解决方案和标准制定[12, 13, 14]。

文件标准

各种文件标准的制定工作正在进行中，以支持不断发展的行业。事实上，CBER FDA在 2014年认识到标准的重要性，组织了“FDA研讨会：协同努力在细胞疗法和再生医学的标准开发中”，以启动旨在文档标准开发的各种努力的协调[15]。由于FDA研讨会和各种后续讨论，再生医学标准协调机构(SCB)于2017年成立，以促进标准制定。特别是，SCB创建并维护了一个在线搜索工具，用于搜索与再生医学相关的所有现有标准和正在开发的标准，包括细胞和基因疗法[16]。虽然自2014年以来已经针对各种治疗产品发布了大量标准，但仍然需要改进标准基础设施来支持分析方法的开发和实施。此外，对于给定的产品开发周期如何以及何时可以使用各种标准并不明显。正在努力提供具体示例，说明如何将多个标准一起用于给定的工作流程。

当前的分析方法标准包括为设计适用的分析方法提供合理原则的标准，为给定分析方法/平台（例如PCR、NGS、成像等）提供最佳实践的标准，或专注于特定的样品类型（例如，核酸、给定的细胞类型）。因此，预计几个标准可能对特定测量有用，以满足不同最终用户的需求。

竞争前标准可以提供通用方法和原则，以应对方法开发、验证和桥接研究方面的挑战，从而使每个实体更容易进行这些研究，从而减轻每个实体的负担。分析方法标准旨在大大加快验证分析方法的进程。重要的是要注意验证需要使用代表最终产品的样品。因此，实施标准的目的是通过在认证阶段提供指导和最佳实践来压缩分析开发时间表。一套全面的分析方法标准的可用性将简化该方法开发过程。

分析标准的另一个重要组成部分是通用文档和报告方案。这包括分析方法的结果，包括不确定性分析、用于理解测量量/置信度的（元）数据，包括关键分析参数和控制，以及有关样品的信息，包括样品来源和处理。采用通用报告方案将实现下游数据的互操作性和集成。为了实现数据比较，结果必须首先以共同的规模呈现，这可能具有挑战性，因为可以针对预期目的开发许多分析方法。例如，基于荧光的生物测量，如ELISA和流式细胞术，可用于评估抗体结合。然而，如果没有协调策略，就不可能整合ELISA和细胞计数数据，因为测量输出可能相差几个数量级。此外，由于仪器（例如激光器和过滤器）的差异，单独流式细胞仪的读数可能会有很大差异。

测量保证策略

虽然平台和文件标准将大大加速分析开发，但可能需要额外的测量保证策略才能达到验证。分析方法可以被认为是一个包括分析前阶段、分析阶段和分析后阶段的过程（图 1）。分析方法有一个输入测试样品，它可以具有一系列特性。分析前阶段可以包括样品选择和收集、样品储存和运输以及与分析方法相关的试剂/耗材/测试套件等过程。在分析阶段，测试样品通过取样、稀释、染色等步骤进行分析，然后引入分析仪器进行数据收集。在分析后阶段，对数据进行分析，并根据用户定义的规范做出决策。分析方法过程中的每个步骤都可能引入误差或不确定性的来源。这些误差来源可以在不确定性分析中正式识别，并通过石川图或鱼骨图可视化。在识别潜在的测量误差来源时，通常可以实施测量控制策略来减轻、纠正或监控潜在的测量挑战（[8,17，18*]）。

如果可用，参比品是仪器性能表征、实验方案评估和提供测量可追溯性的重要工具 [18*]。此外，参比品可用于多种用途，包括仪器鉴定、验证和验证、分析方法校准以及培训或能力测试。在缺乏用于评估方法性能的适当参比品的情况下，适当的实验设计和统计分析策略可以提供对方法质量的洞察。例如，在细胞计数中，不是将细胞计数值与可能由于参考方法（例如血细胞计数器计数）的不精确性而质量较差的参考值进行比较，而是可以通过比较来自稀释系列研究以理想的比例响应稀释[11,19]。测量保证策略和测量不确定性的表征对于提高生物科学研究的整体质量和解决研究结果的不可重复性挑战至关重要，这些挑战可能阻碍MOA的识别和产品在开发过程中的进展 [18]。

可用的工具和技术

能够实施测量保证策略的工具可以促进验证方法的开发。例如，分析方法自动化是一种支持工具，是一种快速发展的能力。分析仪器现在可以按顺序执行多种分析方法（例如，在96孔板或旋转带中的管中）。该行业越来越多地寻求自动化分析方法的分析前过程，以进一步提高通量并减少此阶段已知发生的显着变化。粗略地说，分析方法的自动化意味着通过一个或多个机器人系统和分析管道将手动过程转换为自动化过程。因此，通过集成多个复杂的机器人系统以及分析程序，努力实现整个分析方法的自动化。

包含所有分析前、分析和分析步骤的全自动分析方法将是测试大量样品或通过具有明确规格的经过验证的分析方法进行常规测试的理想选择；然而，即使是部分过程的自动化也可以极大地提高测量精度。此外，自动化的使用可以大大加快分析方法的开发和优化过程。自动化可以作为一种工具来理解和最小化分析方法中的各种可变性来源。后者具有灵活自动化的显着特征，这是一种制造自动化，允许以小批量或单位批量生产各种零件类型。类似地，灵活自动化系统的设计和编码将不同于常规自动化，在常规自动化中，系统是为一组明确定义的操作而设计的。因此，重要的是要考虑正确的自动化水平。在产品开发的早期阶段，可能只适合实施自动化以取代分析方法的特定步骤（例如，液体处理）。随着分析方法和测量变异性的来源得到更好的定义，可以实现更多的自动化。

人工智能和机器学习(AI/ML)是另一个新兴领域，可提供强大的能力以极大地加速分析开发。人工智能已经用于基因组分析、成像分析以及其他分析能力。AI/ML通常需要高质量的数据来开发和基准测试。测量基础设施将支持该领域的进步，特别是考虑到可能需要实施新方法来支持基于人工智能的分析方法的验证。

展望

鉴于细胞和基因治疗产品的复杂性和广泛性，目前的方法通常试图在产品质量和制造过程方面测量尽可能多的工艺步骤。这种方法可能效率低下，并且可以说是不可持续的。美国国家科学院、工程院和医学院最近举办了一次研讨会，探讨如何使用跨学科系统思维方法来支持相关质量属性的识别以及简化制造和监管流程[20]。以系统为中心的方法被描述为“旨在更好地定义生物学结果中涉及的机械参数，并通过识别那些更能提供最重要的预测性和可操作性的分析物来收集和使用更多相关数据”有关产品的信息。这些努力将得到上述测量基础设施的支持，以便适当关注产品开发。

随着行业的不断成熟，分析方法将发挥越来越重要的作用。应继续协调开发竞争前测量解决方案，并进一步推动创新测量平台和技术的发展。分析开发可以通过一个明确的计划来选择适当的分析方法和一个清晰的理解和方法验证的路径来进一步简化。标准对于提供最佳实践至关重要，包括整合各种数据以实现以系统为中心的稳健方法。

参考来源：

Advancing measurement infrastructure for cell and gene therapy product development

https://doi.org/10.1016/j.cobme.2021.100329

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