Cell Research | 苏昭铭/赵克雷解析铜绿假单胞菌sRNA RsmZ冷冻电镜结构并揭示细菌毒力调控机制

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关键词：揭示Cell

资讯来源：BioArt

发布时间： 2023-03-05

铜绿假单胞菌 是一种广泛存在的机会性致病菌，常在住院患者中引起院内感染，其致死率很高，耐药性强。依赖于VI型分泌系统 (T6SS) 和生物膜 (biofilm) 等毒力表型形成的慢性感染是一种普遍的耐药机制，使得细菌很难被清除。同时基于细菌细胞密度的通信网络——群体感应 (quorum sensing, QS ) 也可以调节许多急性和慢性毒力相关的基因表达。前期研究表明，铜绿假单胞菌中次生代谢物阻遏 (the repressor of secondary metabolites, Rsm ) 系统中的全局调控蛋白RsmA主要通过转录和转录后调控来影响各种毒力因子的表达。

非编码小RNA (non-coding small RNA, sRNA) RsmZ可以结合RsmA蛋白来抑制其功能，从而促进铜绿假单胞菌毒力因子表达。虽然前期结构功能研究揭示了假单胞菌属Rsm家族同源二聚蛋白如何识别两个独立茎环 (SL) 结构上的“GGA”结合位点，并运用核磁共振 (NMR) 和电子顺磁共振 (EPR) 预测了荧光假单胞菌中RsmE与截短RsmZ在溶液中结合的两种构象，但是全长RsmZ的结构及其通过结合RsmA调控病原菌毒力的分子机制仍然未知。

2023年2月24日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室苏昭铭团队，联合成都大学抗生素研究与再评价四川重点实验室赵克雷团队，共同在Cell Research杂志上在线发表了最新研究成果 Structural basis of sRNA RsmZ regulation of Pseudomonas aeruginosa virulence 。该研究采用单颗粒冷冻电镜技术 首次解析了全长RsmZ结合RsmA的结构并揭示其调控铜绿假单胞菌毒力的分子机制 （图1） 。

图1 全长RsmZ结合RsmA二聚体复合物冷冻电镜结构示意图（a-b）以及野生型以及各种突变体RsmZ对于铜绿假单胞菌中毒力相关基因表达调控（c）。

该研究通过冷冻电镜结构鉴定了三个“夹子”状RsmA结合位点；运用突变和回补实验发现了结合位点茎环结构的互补配对对RsmZ结合RsmA至关重要；并通过构建RsmY/Z敲除菌株并回补野生型和不同突变型的RsmZ，验证了RsmZ通过形成复杂三维结构结合RsmA来调控包括生物膜形成、T6SS、QS等细菌毒力相关因子的表达，并影响下游生物膜、绿农菌素生成等相关表型。因此该研究为以铜绿假单胞菌sRNA RsmZ为新型RNA靶点开发靶向RNA药物来对抗细菌耐药性提供了结构生物学基础。

值得一提的是，本研究中的RNA结构还提供给了第15届蛋白质结构预测大赛（CASP15）首次举办的RNA结构预测比赛作为预测目标（R1189和R1190，图2）。在CASP14中，AlphaFold2、RoseTTAFold等在蛋白质结构预测中超高精度（RMSD < 1Å）的出色表现使得蛋白质结构预测领域得到突飞猛进的发展。然而，现有人工智能算法对于RNA结构预测的准确性仍是个谜。因此CASP15举办了首次RNA和RNA蛋白复合物结构预测大赛，来自世界各地的课题组利用基于深度学习和能量函数等各种方法对于十二个不同的RNA靶点进行了结构预测 （图2） 。结果显示，预测结果与实验结构比较后普遍偏差都很大（RMSD > 6Å），而对RsmZ结构的预测没有一个团队得到接近实验的结果（RMSD 全部在15-30 Å）。究其根本，目前已知RNA结构数目很少，同源序列寻找困难，为深度学习所需的大数据库带来了极大的挑战，体现出对RNA结构的精准预测仍然任重道远。

图2 CASP15大赛中各参赛组的RNA靶点结构预测结果（本研究所提供靶点的预测结果为红色）

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室、华西医院老年科与国家老年疾病临床医学研究中心为本研究的第一完成单位和通讯单位。

四川大学华西生物治疗国重冷冻电镜技术平台拥有300和200千伏前沿冷冻电镜、光电联用（CLEM）系统，可以进行高分辨单颗粒重构、断层成像（Cryo-ET）、微晶衍射（MicroED）等数据收集，长期招聘具有一定电镜操作经验的工作人员；苏昭铭课题组的研究兴趣围绕通过冷冻电镜揭示病原RNA和RNA蛋白复合物的结构和功能，并基于RNA结构设计和筛选RNA靶向小分子化合物，作为潜在的分子探针和候选药物。课题组长期招聘博士后和科研助理，有意向者可以扫码投递简历或访问课题组网站www.zsulab.com。

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