Cancer Discovery | 以N-连接糖基化为目标治疗侵袭性淋巴瘤的新策略

撰文 | Qi

弥漫性大B细胞淋巴瘤 （Diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL ） 是一种侵袭性癌症，主要包括活化B细胞样 （ ABC ） 和生发中心B细胞样 （ GCB ） DLCBL两种亚型，多平台基因组分析将其进一步细分为7个亚型。DLBCL肿瘤经常依赖于B细胞受体 （ BCR ） 信号触发下游激酶的级联，最终导致NF-kB或PI3激酶的激活。然而，引发这种病理性BCR信号传导的机制在DLBCL的分子亚型中有所不同，因此，针对下游NF-kB和PI3激酶激活的治疗药物仅在一些亚型中具有临床活性 【1-3】 ，这促使人们寻找直接靶向近端BCR信号传导的策略。

近日，来自NIH的Louis M. Staudt团队在Cancer Discovery杂志上发表了一篇题为 Targeting N-linked Glycosylation for the Therapy of Aggressive Lymphomas  的文章， 通过全基因组CRISPR-Cas9筛选、蛋白质组学和超分辨率显微镜分析，发现了一个以前未知的N-连接糖基化调控BCR信号的机制，对OST-B的抑制足以损害BCR信号传导并杀死依赖BCR的DCBCL模型，因此，OST-B的选择性小分子抑制剂可能对这些侵袭性癌症具有治疗潜力 。

为了发现DCBCL的治疗漏洞，研究人员首先利用全基因组CRISPR-Cas9筛选以确定NF-kB靶基因IRF4的调节子，结果显示IRF4在ABC细胞中的表达因N-连接寡糖转移酶-B （ OST-B ） 的失活明显减弱，用OST抑制剂NGI-1处理ABC细胞也能明显降低IRF4蛋白及mRNA水平。研究人员在22个ABC和GCB DCBCL系中评估OST-B特异性亚单位STT3B失活的影响，发现对5个ABC和3个GCB系具有毒性，STT3A （OST-A亚单位） 和STT3B的双重敲除比STT3B的单一敲除对OST依赖性品系的毒性更大。随后，作者在STT3A或STT3B缺陷的ABC细胞中进行了基于质谱的糖蛋白组学研究，并量化了N-连接糖基化位点的整体变化。CD79B中的两个糖基和CD79A中的一个糖基因STT3B的失活而降低，相反，TLR9上的三个糖基在STT3A敲除的细胞中减少，提示OST-A和OST-B有助于BCR亚基的糖基化，NGI-1处理也能得到类似效果。研究人员假设BCR的去糖基化可能改变其在ABC表面聚集，超分辨率显微镜的观察结果与猜想一致，STT3B缺陷的ABC细胞中BCR的表面聚集明显减少，说明OST-B是ABC DLBCL中慢性活性BCR信号的一个关键调节因子。

BCR在质膜上的分布改变可能会影响其与其他膜蛋白的联系，进而阻碍信号传导。为了探索这种可能性，作者在ABC细胞中表达了CD79A-BioID2融合蛋白，以允许杂交的生物素化酶BioID2对BCR附近的蛋白质进行生物素化，进而通过定量质谱法检测。值得注意的是，NGI-1处理后BCR与CD22 （可负向调节BCR信号的B细胞特异性表面受体） 接近，如果用NGI-1处理表达CD22-BioID2融合体的ABC细胞，也会增加CD79A、CD79B的生物素化，支持CD22被募集到去糖的BCR。为了评估CD22募集的功能后果，作者利用sgCD22使之缺失，看是否会减少NGI-1对DCBCL细胞的毒性作用。结果显示在用NGI-处理的细胞中，CD22敲除细胞的比例随时间增加，说明CD22是NGI-1的毒性作用所必需的。

在带有MYD88 L265P突变的ABC DLBCL亚型中，My-T-BCR多蛋白超级复合物充当中心信号枢纽 【3】 。作者发现用NGI-1处理细胞可以减少My-T-BCR复合物的形成，原因可能是去糖的BCR从质膜到溶酶体的转运过程被破坏，将抗IgM Fab片段与 "pHrodo "荧光染料相结合观察BCR的内化行为，可以发现溶酶体中BCR丰度有所下降。

接下来，作者用全基因组CRISPR筛选以确定协同或拮抗NGI-1杀死淋巴瘤细胞能力的细胞通路。STT3B和STT3A以及OST-复合物的其他组分在这一筛选中得到了很高的协同效应，支持NGI-1对OST具有高的靶向活性的观点，相反，ALG基因家族成员的失活则削弱了NGI-1的作用。激活BCR依赖的NF-kB途径的几个成分与NGI-1协同作用，而该途径的负向调节子的失活则促进了NGI-1的抗性，PI3激酶/mTOR途径成分的失活与NGI-1协同作用，而该途径的负调节子的失活降低了NGI-1的作用。这些数据表明，针对BCR依赖的NF-kB途径和PI3激酶/mTOR途径的药物可能与OST抑制剂协同发挥杀死DCBCL细胞的作用。为了证明这点，作者在ABC细胞中进行了药物筛选，NGI-1与多种PI3激酶抑制剂的组合产生了对ABC细胞的协同杀伤作用。最后，作者在三个ABC异种移植模型中评估了单药和联合治疗的效果，在所有三个模型中，NGI-1的单药治疗减少了肿瘤的形成，而添加PI3K抑制剂则能增加这种效果，且没有表现出明显的毒性迹象。

综上所述，这项工作 揭示了一种N-连接糖基化调控BCR信号的新机制，并指出靶向抑制OST可能被用于治疗淋巴瘤和其他依赖病理受体信号的恶性或非恶性疾病。

原文连接：

https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-22-1401

制版人：十一

参考文献

1. Wright GW, Huang DW, Phelan JD, Coulibaly ZA, Roulland S, Young RM, et al. A Probabilistic Classification Tool for Genetic Subtypes of Diffuse Large B Cell Lymphoma with Therapeutic Implications. Cancer Cell 2020;37(4):551-68 e14 doi10.1016/j.ccell.2020.03.015.

2. Young RM, Phelan JD, Wilson WH, Staudt LM. Pathogenic B-cell receptor signaling in lymphoid malignancies: New insights to improve treatment. Immunol Rev 2019;291(1):190-213 doi 10.1111/imr.12792.

3. Phelan JD, Young RM, Webster DE, Roulland S, Wright GW, Kasbekar M, et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature 2018;560(7718):387-91 doi 10.1038/s41586-018-0290-0.

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