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前言 ·
提质粒是绝大多数生物人入坑的第一个实验，可以说是基础中的基础，它不需要多么华丽的技巧，照着提取试剂盒一步一步操作就可以。但是简单的实验也会有结果的差别，有的人提的多，有的人提的少，有的人提的好，有的人提不出来，形形色色的问题困扰着大家，也有了今天的这篇文章，毕竟抽提得出的质粒的质量和数量将直接决定着下游实验的成败。
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。在分子生物学实验中，通常将目的基因插入到质粒的多克隆位点上，构建新的重组质粒，目的基因可以随质粒载体进入到受体细胞中。利用质粒上的元件，可以在受体细胞中进行复制和表达，随宿主细胞的分裂，转移到子代细胞中。不同的下游实验，对质粒的提取量和纯度也会有所差别。获得高品质的质粒对下游实验起到非常重要的作用。
质粒提取主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA，和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取方法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是：强碱（pH12.0-12.6）环境下，SDS破坏细胞壁并裂解细胞，同时使宿主细胞的蛋白质、染色体及DNA发生变性，而质粒DNA由于其分子量小而缠结紧密不易变性。pH调至中性时可恢复天然构象，在高盐条件下，细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉淀，离心后可去除。上清中的质粒DNA可通过乙醇沉淀或者硅胶膜特异性吸附等方式，将质粒DNA从上清中回收。
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Q：质粒提取的方法有哪些？
可以用于质粒DNA分离纯化的方法有：碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法和有机溶剂法等，大多数的质粒抽提试剂盒采用的方法是碱裂解法。针对于一些分子量大、拷贝数低的质粒DNA，仅用试剂盒提取还很难获得高纯度、高浓度的质粒，需要试验者在理解质粒提取原理的基础上，针对不同的菌种、不同的质粒，有效控制提取过程中的各种因素，才能获得理想的结果。
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Q：影响质粒提取的因素有哪些?
质粒提取的纯度和得率与很多因素相关，比如：质粒自身的复制能力、稳定性、宿主菌株的种类和培养条件、菌体裂解是否充分、抗生素、硅胶膜的吸附能力、试验者操作的熟练度等等，都会影响到质粒的提取效果。
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Q：提不出质粒或质粒提取量很少
菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次摇菌后可能导致质粒丢失。
菌种老化：如果是甘油菌，建议涂布平板培养后，重新挑选菌落后再进行液体培养。
质粒拷贝数低：某些质粒属于低拷贝类型，也会引起质粒提取量低，尽量换用相同功能的高拷贝质粒，或者同时增加菌体和试剂的使用量
碱裂解不充分：质粒提取过程中，并非菌体量越高提取量越高，使用过多的菌液，会导致菌体裂解不充分，可适当增加下游提取试剂的使用量或者减少菌液用量。
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Q：质粒中基因组污染是怎么产生的？
基因组污染一般是由于操作过于剧烈产生的，如果为了提高混合效果，采用涡旋振荡的方式来进行混匀，基因组DNA会被剪成小片段，在中和过程中被复性，保留在上清中随质粒DNA一起被回收。所以在质粒提取过程中，动作要尽量温和。
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Q：为什么有些质粒，纯化后长时间放置会降解？
产生这种现象的主要原因是核酸酶污染，除了在制备时容易引入外源核酸酶之外，质粒宿主细胞也会影响抽提质量，JM系列细胞中含有丰富的核酸酶活性，如果制备的质粒需要长期保存，建议更换宿主细胞，如DH5α、XL1-Blue，用于抽提高质量质粒。
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Q：之前测序没问题的菌液，37℃扩大培养后，质粒的大小或序列出现异常？
这种情况一般出现在大质粒或较特殊的序列中，可能是在大肠杆菌中复制时发生了重组，可以更换重组酶缺失的菌株，比如JM109、sure菌株，使质粒复制更加稳定。
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Q：电泳检测质粒DNA常见的几种形态
一般来说提取的质粒有三种形态，电泳图从上而下分别是开环DNA、线性DNA和超螺旋DNA。如果提取的质粒污染比较严重，在电泳图上甚至还会看到宿主细胞的基因组和RNA污染。双螺旋质粒的含量是判断质粒提取效果的重要指标，双螺旋质粒的转染效率最高。在实际操作过程中，有时我们只能看到两条条带，甚至是一条，可以通过单酶切线性化质粒和原始质粒同时进行电泳，线性化条带所处的位置指示的是质粒的实际大小，而根据相对迁移速度，来判断另一条条带是开环质粒还是超螺旋质粒。
质粒常见的三种形态
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Q：质粒的拷贝数由什么决定的？
质粒根据复制特性可以分为严紧型和松弛型，严紧型质粒在宿主细胞中仅含有1-2个，它的复制与宿主细胞染色体受相同因素的控制，在一定的细胞周期内复制。严紧型质粒分子量较大，比如F质粒和P1质粒。而松弛型质粒在宿主细胞中含有十几个，甚至是几十个，在整个细胞生长周期中可以随时复制。松弛型质粒分子量较小，比如pBR322（15-20copies）、ColE1（20-30copies）、pUC（30-50copies）质粒。一般情况下，质粒的拷贝数是由其复制子（ori的种类）决定的，有时也会受到宿主细胞的种类、细胞的培养环境的影响。
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Q：常见的低拷贝质粒是严紧型质粒吗？
商业化载体几乎都属于松弛型质粒，但质粒的拷贝数有所不同，比如植物表达载体pBI121，载体上含有从ColE1来源的ori复制元件，虽然也是松弛型质粒，但相对于pUC质粒来说，拷贝数较低，在质粒提取时，需要较大的菌体量，获得的质粒量才能达到实验需求。pBR322也是我们常见的一款低拷贝质粒，包含一个复制起点（ori）、一个Ampicilin抗性片段（AmpR）和一个tetracycline抗性片段（TetR），可以作为载体骨架，构建各类载体。pBR322的复制子并不是一个能诱导超高复制能力的起点，但也可以保证每个宿主细胞包含15-20个质粒。针对于这类质粒，可以在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，氯霉素可以抑制宿主细胞中蛋白质的合成，阻止细菌染色体的复制，然而松弛型质粒仍可继续复制，在加入氯霉素的若干小时内，拷贝数持续递增。
pBI121载体图谱示意图
pBR322载体图谱示意图
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Q：应该选择什么级别的质粒？
不同级别的质粒适合于不同的下游实验，如果下游用于酶切、测序、亚克隆、转化和基因表达等常规分子生物学实验，手提和试剂盒提取制备的质粒均能达到需求。如果下游需要将质粒转染至细胞中或者显微注射到实验动物体内，则要求质粒的内毒素含量和超螺旋比例达到一定的标准。内毒素会影响质粒的转染效率和转染后细胞状态，质粒超螺旋比例越高，其转染效率及表达量也会越高。
质粒提取并不难，但要又快又好提取出符合下游实验要求的质粒，无疑会对我们的实验起到锦上添花的作用。本期的质粒抽提小课堂就到这里啦，祝大家实验顺利，我们下期再见啦！
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参考文献：
1. Cupillard, Lionel, et al.Vaccine 23.16 (2005): 1910-1916.
2. Pillai, Vinod Bhaskara,et al. Vaccine 26.8 (2008): 1136-1141.
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