Nature | 伊成器课题组揭示线粒体编辑器具有广泛的核基因组脱靶编辑

碱基编辑器是基因编辑领域的一类重要工具。2016年，Broad研究所的David R. Liu 课题组首次报道了胞嘧啶碱基编辑器 （Cytosine Base Editor, CBE） 。CBE可以实现核基因组靶向位置的C·G → T·A 碱基编辑，并从原理上避免了DNA双链断裂的产生 【1,2】 。虽然通过CBE以及后续的ABE，CGBE，PE等基因编辑工具已经可以实现核基因组的精准、高效地碱基编辑，但是真核细胞内缺乏将sgRNA转运至线粒体的机制，因此，无法应用上述依赖于 sgRNA 定位的基因编辑工具实现线粒体基因组的精准编辑。

 

2020年，David R. Liu团队与 Joseph D. Mougous 团队合作，报道了能够进行 线粒体DNA 单碱基编辑的工具——DdCBE。该研究使用了 Mougous 团队新发现的具有双链 DNA 胞嘧啶脱氨活性的细菌毒素 DddA，并将其分裂为两个 DddA 半体以减弱其细胞毒性，每个半体与一个 TALE序列相连接，在线粒体靶向信号（MTS）的介导下进入线粒体中，经由两个TALE序列完成 mtDNA 特异性靶向定位，将两个 DddA 半体带到同一空间位置，组合成具有胞嘧啶脱氨活性的完整 DddA，完成 mtDNA 靶向位置的 C·G → T·A 碱基编辑 （详见BioArt报道：Nature新突破 | David Liu开发新工具实现线粒体内的高效单碱基编辑） 【3】 。DdCBE 使得线粒体基因组精准定向编辑真正意义上得以实现，该工具很快在多种体系中得到应用 【4-7】 。

DdCBE 工作机制示意图 【3】

 

通过MTS介导，DdCBE 能够集中定位在线粒体中并且完成线粒体基因组编辑 【3】 。然而，一个的潜在安全隐患是，MTS 的介导能否保证全部 DdCBE 定位在线粒体中，而不是部分泄露到细胞核，从而造成潜在的脱靶编辑。因此，对于使用DdCBE成功实施线粒体碱基编辑的样品，其核基因组脱靶效应及工具本身的安全性评估是极为必要的。

 

2022年5月12日，北京大学伊成器团队在 Nature 在线发表题为 Mitochondrial base editor induces substantial nuclear off-target mutations 的研究论文 【8】 。该研究应用了该团队于2021年发表在Nature Methods的Detect-seq技术 （详见BioArt报道：Nat Methods | 伊成器课题组开发胞嘧啶碱基编辑器全基因组脱靶效应检测的新工具） ， 在人类HEK239T细胞系中详细评估了DdCBE 在进行线粒体编辑时，由于泄露至细胞核而导致的核基因组脱靶编辑效应，并探究了其核基因组脱靶作用机制和工具的优化方案。

该团队发现，通过 MTS 靶向到线粒体的 DdCBE，在发挥线粒体基因组基因编辑功能的同时，一小部分进入了细胞核，并在细胞核基因组中产生了广泛的脱靶编辑 （图 1） 。研究发现 DdCBE能够造成两种具有典型特征的核基因组脱靶编辑类型：依赖于单侧TALE序列 （TAS-dependent） 的脱靶编辑 （图 2） ，和非随机的、不依赖于TALE序列 （TAS-independent） 的脱靶编辑 【8】 。

该团队测试了5种先前开发的 DdCBEs （ND6-L1397N, ND5.1-L1397N, ND4-L1397N, ND5.3-L1397C 和 ND4-L1397C） ，在实现相关4个线粒体基因组位点 （ND4, ND5.1, ND5.3, ND6） 靶向编辑的同时，检测到了几十到几百个细胞核基因组脱靶编辑位点 （697, 652，100，610 和 91） ，并使用靶向深度测序技术进行了验证。值得注意的是，今年3月份的一项独立研究发现，在小鼠早期胚胎中应用DdCBE也在核基因组中造成了广泛的脱靶编辑 【9】 。 

 

 图 1 DdCBE 能够产生广泛的核基因组脱靶编辑

 

如图 2等所示，该团队发现，依赖于单侧TALE序列的脱靶编辑类型，仅靠单侧 TALE 序列进行基因组定位，而非依赖于双侧 TALE 序列进行定位 【8】 。而根据设计初衷，DdCBE 将在两个设计好的 TALE 序列共同靶向下完成定位和碱基编辑 【3】 。该团队发现的这一脱靶编辑特性可能意味着 DdCBE 存在更多潜在的 TALE 序列依赖的脱靶位点；这一脱靶编辑特性也对双侧 TALE 序列的设计也提出了更高的基因组特异性要求 【8】 。

图 2 依赖于单侧TALE序列的脱靶编辑示意图 【8】

 

该研究随后报道了大量不依赖于TALE序列定位的 （TAS-independent） 的脱靶编辑 ，这种脱靶编辑位点的序列特征并没有和 DdCBE 两侧 TALE 序列中的任一个具有良好的匹配，但却并不随机出现，而是在不同种类的 DdCBEs 中共享 【8】 。

 

该团队随后对这种 TAS-independent 脱靶类型进行了深入研究，发现在这些脱靶位点的下游约10bp处，能够找到与 CTCF 结合基序 （motif） 几乎一致的序列特征，这提示了这种非随机性脱靶可能与 CTCF 存在某种关联。

 

随后的分析发现 TAS-independent 脱靶编辑与 CTCF 和cohesion的ChIP-seq信号具有极强的共定位。

 

而CTCF是一种重要的结构蛋白，能够与 cohesion相互作用，并在核基因组三维结构维持中发挥重要作用 【10,11】 。这提示了该型脱靶可能与三维结构相关，随后通过与Hi-C数据的联合分析也印证这一观点，TAS-independent 脱靶编辑显著富集在拓扑关联结构域 （Topologically Assocaited Domain，TAD） 边界。随后，该团队通过生化实验发现DdCBE的确能够和细胞内源CTCF产生相互作用。

 

基于对 DdCBE 细胞核基因组脱靶编辑机理的深入理解，该团队尝试了几种对 DdCBE 的优化手段 （图 3） ：（1）使用核输出信号 （nuclear expotr-signal，NES） 使DdCBE不定位在细胞核中；（2）使用核定位的 DddIA 抑制核内 DdCBE 的核基因组编辑活性；（3）寻找削弱核编辑活性的DdCBE突变体，成功将其核基因组脱靶影响降到了较低水平：使用核输出信号 （NES） 的策略成功降低了DdCBE的核基因组脱靶水平，而几乎未影响线粒体基因组背景；使用核定位DddIA 抑制DdCBE编辑活性的策略能够极大地降低 DdCBE 的核基因组编辑影响，同时也观察到了线粒体基因组背景的降低；而使用Q1310A突变体则可以略微降低核内TAS-independent脱靶类型的影响，同时也降低了其线粒体基因组背景。

 

图3 DdCBE 优化策略示意图【8】

总的来说， 该研究使用了Detect-seq技术对DdCBE碱基编辑工具的在人类细胞中核基因组脱靶编辑进行了无偏向性地评估，并探索了相关机制，发现了TAS依赖型和TAS非依赖型的脱靶；并意外发现由细菌毒素 DddA 构成的 DdCBE 碱基编辑工具与维持细胞三维结构的重要蛋白 CTCF有相互作用。

 

经过近年的努力，人类已经能够相对容易地进行核基因组 【1,12-15】 与线粒体基因组 【3,16】 碱基的定向编辑，且相关的临床试验也正在进行。如何能够安全可靠地将这些工具应用在人类疾病的临床治疗中，将是未来基因编辑领域的研究重点。安全性评价手段的出现以及 BE 工具的优化升级，让我们看到了未来使用 BE 工具用于遗传疾病治疗的希望。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04836-5

参考文献

1.Komor, A.C., et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016. 533(7603): p. 420-424.

2.Cullot, G., et al., CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations. Nature communications, 2019. 10(1): p. 1-14.

3.Mok, B.Y., et al., A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature, 2020. 583(7817): p. 631-637.

4.Wei, Y., et al., Human cleaving embryos enable efficient mitochondrial base-editing with DdCBE. Cell discovery, 2022. 8(1): p. 1-4.

5.Chen, X., et al., DdCBE-mediated mitochondrial base editing in human 3PN embryos. Cell discovery, 2022. 8(1): p. 1-4.

6.Kang, B.-C., et al., Chloroplast and mitochondrial DNA editing in plants. Nature Plants, 2021. 7(7): p. 899-905.

7.Guo, J., et al., DdCBE mediates efficient and inheritable modifications in mouse mitochondrial genome. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2022. 27: p. 73-80.

8.Lei, Z., et al., Mitochondrial base editor induces substantial nuclear off-target mutations. Nature, 2022.

9.Wei, Y., et al., Mitochondrial base editor DdCBE causes substantial DNA off-target editing in nuclear genome of embryos. Cell discovery, 2022. 8(1): p. 1-4.

10.Busslinger, G.A., et al., Cohesin is positioned in mammalian genomes by transcription, CTCF and Wapl. Nature, 2017. 544(7651): p. 503-507.

11.Wang, D.C., et al. A tour of 3D genome with a focus on CTCF. in Seminars in Cell & Developmental Biology. 2019. Elsevier.

12.Gaudelli, N.M., et al., Programmable base editing of A• T to G• C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017. 551(7681): p. 464-471.

13.Li, X., et al., Base editing with a Cpf1–cytidine deaminase fusion. Nature biotechnology, 2018. 36(4): p. 324-327.

14.Kurt, I.C., et al., CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells. Nature biotechnology, 2021. 39(1): p. 41-46.

15.Zhao, D., et al., Glycosylase base editors enable C-to-A and C-to-G base changes. Nature biotechnology, 2021. 39(1): p. 35-40.

16.Cho, S.-I., et al., Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell, 2022.

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