抗体由两个相同的轻/重链异二聚体组成，分子量约150 kDa。单链抗体
（single chain variable fragment,
scFv
）
由抗体的重链和轻链可变区通过一段柔性多肽连接而成。scFv分子量仅约30 kDa，具有更高的组织穿透能力，在体内比抗体更快地被清除。scFv可避免由Fc区介导的免疫反应。这些特征使scFv更适合应用在体内影像诊断、肿瘤和细胞内病原体的靶向治疗等领域。
Fc区可形成链内和链间二硫键和其它非共价键而有助于抗体稳定性。由于缺少Fc区，scFv稳定性不如抗体。scFv在热激条件下易于去折叠
（unfold）
和形成聚集体
（aggregate）
而产生意外的免疫原性和毒性。直到2020年只有2个大肠杆菌表达的scFv被批准临床使用。
近日，复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室王勇翔课题组联合中科院上海药物所新药研究国家重点实验室罗成课题组在大肠杆菌表达的单链抗体溶解度和稳定性领域取得进展，该成果于2022年8月8日在线发表在Nature Communications杂志，题为：
A 33-residue peptide tag increases solubility and stability of Escherichia coli produced single-chain antibody fragments
。
scFv的重链和轻链可变区的链内二硫键对于其稳定性至关重要。普通大肠杆菌细胞浆不仅缺少催化二硫键形成的组分还具有谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶还原二硫键，因此绝大多数在普通大肠杆菌细胞浆表达的scFv都呈不溶性的包涵体。细菌周浆间隙虽具有氧化性环境和巯基-二硫键氧化还原酶
（如DsbA 和DsbB）
但是大部分scFv表达产量都很低。最近，科学家通过失活谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶通路和组成性地表达二硫键异构酶DsbC构建了大肠杆菌工程菌株
（如SHuffle菌株）
，从而提高了一些scFv在SHuffle菌株中的表达溶解度，但仍还有一些scFv在SHuffle菌株中的表达溶解非常低，而且大肠杆菌表达的scFv的低稳定性问题仍未解决。
一些特殊scFv的轻/重链可变区相互作用很强，它们折叠可不依赖链内二硫键而在普通大肠杆菌细胞浆中可溶性表达。一些具有促溶活性的蛋白标签如MBP、GST、NusA和Trx等能够进一步提高它们的溶解度。但大部分scFv的轻/重链可变区相互作用都很弱，在普通大肠杆菌细胞浆中呈不溶性表达，因此需要通过费时费力的变性/复性步骤形成有活性的scFv。此外，如MBP之类的促溶标签蛋白因体积庞大而形成空间位阻干扰scFv与抗原结合，因此必需通过蛋白酶切去除；但是去除了促溶标签蛋白又会使scFv不稳定，诱导产生无活性的聚集体。
来自T7噬菌体尾部的P17蛋白通过一段由33个氨基酸组成的多肽
（称作
P17
多肽或标签）
与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体相关蛋白
（LRP）
特异性结合将噬菌体颗粒和小分子、蛋白、核酸以及脂质体等靶向运送到肝细胞。王勇翔课题组曾经构建了靶向乙肝病毒包膜蛋白的G12-scFv，该抗体能够被肝细胞内吞而选择性抑制乙肝病毒病毒体分泌
（Antiviral Research, 2019, 162: 118-129）
。为了提高G12-scFv被肝细胞内吞的效率，研究者将P17标签融合在其羧基末端。在用大肠杆菌SHuffle菌株表达G12-scFv-P17蛋白时，意外地发现它的溶解度显著高于G12-scFv蛋白。通过半定量溶解度测定实验还发现P17标签还能有效地提高其它3种不同scFv在SHuffle菌株中的溶解度。P17标签对scFv的促溶效应与它在氨基和羧基末端的位置无关。通过缺失突变和点突变分析发现P17标签对scFv的促溶效应与它的亲水序列尤其是带电氨基酸残基相关，而与可能存在的α螺旋二级结构无关。通过热稳定性实验发现P17标签和链内二硫键一样提高scFv的热稳定性。而且P17标签融合的G12-scFv与抗原的结合能力以及它的病毒中和活性提高了超过两倍，这些数据提示P17标签具有I型分子内伴侣样的活性。因此，P17标签将有助于scFv的生产、研究和应用。
该工作的通讯作者为复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室王勇翔副研究员和上海药物所罗成课题组陈示洁副研究员，该工作主要由复旦大学硕士毕业生王阳和袁雯婕以及上海药物所/南昌大学联合培养博士生郭思岐等完成，还得到了复旦大学闻玉梅院士、袁正宏研究员、童舒平教授、陈振国研究员、上海药物所罗成研究员和德国弗赖堡大学Michael Nassal教授等的支持和帮助。关于P17多肽标签已经申请了中国发明专利
（专利申请号：2018107117974）
。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-32423-9
制版人：十一
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