​Science丨光驱动的氯离子泵工作机制

撰文｜望夜

机体对物质的跨膜运输有多种方式，如主动运输、协助扩散等。对离子的转运，需要膜表面转运蛋白的参与，包括离子通道和载体蛋白（离子泵），前者参与离子的被动扩散，无需耗能；后者可以逆浓度梯度实现对不同离子的吸收，需要消耗ATP。氯离子泵就是一类典型的载体蛋白。

微生物对氯离子的运输是其一项基本生理过程，参与渗透压、细胞生长和膜电势的调节。在嗜盐古菌中，如嗜盐古细菌（Halobacterium salinarum）和法老嗜盐碱单胞菌（Natromonas pharaonis）的嗜盐菌紫质（halorhodopsin）负责对卤化物的内向泵入，可与其细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）质子外排泵共同作用形成膜电势差，利用质子移动力驱动ATP的产生。但某些海洋细菌的嗜盐菌紫质，如Nonlabens marinus的视紫红质3（NmHR）的功能仍然未知，推测这类氯离子泵参与ATP的生成并参与维持细胞渗透压平衡【1】。这类光激活的氯泵视紫质已被开发为光遗传学工具用于控制神经元活性【2】。视紫红质蛋白通常由视黄醛（retinal）和视蛋白（opsin）组成，在氯泵中视黄醛通过一种反式构象结合视紫质发光团（chromophore），通过光异构化起始转运循环，其工作模型被认为符合优化的Jardetzky替代进入模型，即光诱导产生的结构改变使得结合位点对底物的亲和力由高转低，从而允许底物进入细胞质释放通道。

首个获得解析的卤素泵视紫质结构来自嗜盐古菌【3】，其中的氯离子结合位点靠近视黄醛的质子化席夫碱（PSB）。为阐释离子转运机制，还需获得带有瞬时氯离子结合位点的结构，但目前报道的此类结构仅有来自古菌嗜盐紫质HsHR【4】和NpHR【5】的质子中间体状态。最近，海洋细菌氯泵NmHR静息状态的结构获得解析【6】，鉴于其与前述HsHR和NpHR的序列相似性仅21%，这说明结构相似蛋白在进行转运时可能使用类似的元件。此外，细菌紫质的光周期（photocycle）也存在相似性，目前认为光周期通常为如下的模式：暗+光照→K→L→M→N→O→暗。但嗜盐菌紫质没有M阶段中间体，表明其缺少PSB的去质子化阶段。

微生物视紫红质对氯离子的转运机制仍有许多未知，例如其如何将光能转化为粒子转运能，如何保证离子的定向转运等。为回答上述科学问题，需要一种在空间上达到近原子水平同时在时间上达到飞秒级别的方法。近年来，使用X-射线自由电子激光（XFEL）的时间串行飞秒激光晶体学（TR-SFX）取得可喜进展，在同步辐射上也可进行类似改造，即时间分辨的串行同步结晶学（TR-SSX）。利用TR-SFX已获得细菌紫质【7】及钠泵紫质KR2【8】的结构。为进一步丰富对自然界中氯离子转运机制的认识，瑞士分子生物学与生物物理学研究所Przemyslaw Nogly研究组综合运用TR-SFX和时间分辨率质谱和多尺度模拟阐述了氯离子泵视紫红质NmHR在转运过程中的结构动态，相关研究结果以Dynamics and mechanism of a light-driven chloride pump为题近日发表在Science杂志。

基于静息状态的NmHR结构在其视黄醛结合口袋的胞外侧鉴定出一个氯离子结合位点，称为Cl351【6】。因此，氯转运到细胞质内需要通过整个视紫质。转运早期这一转运瓶颈确保了光控制的严谨性，即转运只能在光激活下进行。上述结构还显示其中由保守氨基酸构成三个水结合空洞，可能参与转运途径，但未能发现一个允许离子通过的明显通道。且此前的生化研究显示NmHR也可以结合并转运溴离子，亲和力接近氯离子（前者的解离常数为10mM，后者为24mM【9】）。而且由于溴原子在X-射线衍射中可通过反常色散而被定位，作者推测可以使用溴离子模拟氯离子的转运过程，以便捕捉蛋白上的瞬时离子结合位点。使用520nm的射线持续照射经溴离子浸泡的晶体，其中继续激活的NmHR产生光激活状态并伴有一些光周期中间体出现，其中的一些离子结合位点可能被部分占有。作者通过分子置换结合单波长反常色散鉴定出四个分子内位点，且与内部水分子存在交叉：其中一个对应着静息状态的Br351位点，一个位于胞浆侧的亲水空洞内（Br353），另外两个位于胞外部分的亲水空洞中（Br354和Br355）（图1）。

图1 NmHR结构模型

为补充稳定状态的实验并解析中间体结构，作者收集了时间分辨的串行晶体数据，时间跨度介于皮秒（ps）至微秒（μs）间，并在同步辐射光源上收集了毫秒（ms）级数据。以下是具体研究结果：

1、晶体中NmHR的光周期

NmHR是在脂立方（LCP）中结晶的，模拟细胞膜的两亲状态。但是结晶过程和条件可能会影响蛋白的动力学，因此，作者首先探测其在晶体中的光谱过程的产生和恢复：在纳秒到微秒早期，作者观察到K和L中间体的混合；在微秒后期至毫秒时间段，主要出现L中间体衰弱成一个红移的O中间体。而在溶液中时，NmHR的光周期检测显示早期O1的出现伴随着氯离子的释放，随后O2状态的衰弱会被氯离子的摄取所限制。相较于溶液中，晶体中的动力学略有改变，光谱中间体至O1状态呈现出更快的衰弱速率，而O2状态的衰弱速率变慢，氯离子浓度升高可能也对这些变化贡献了作用。

2、 NmHR的激活

微生物视紫质的光驱动离子转运起始于视黄醛由全反式到13-顺式的光异构化。在本研究中，实验显示最快10ps时视紫质已发生异构化，经结构优化获得一个近似平的13-顺式构象，但相较于全反式视黄醛的静息状态倾斜17°。C20上的甲基被推离Trp201，移动大约0.4Å，而Trp99移动约0.3Å，朝向13-顺式-视黄醛并填补到新形成的空间中。

值得注意的是，在视黄醛发生异构化时PSB改变了朝向。在静息状态下，PSB的质子指向胞外侧，与Cl351形成一个氢键；而在10ps时，PSB翻转使其质子指向胞质。Cl351自PSB移开，两者间距增至4.1Å，打破了两者间的氢键，导致结合位点结构不稳定。分子模拟显示，PSB与Cl351电荷分离的10ps间存储了28.2 kcal/mol的能量，足以驱动后续反应。这里被储存的能量源于质子能，在异构化过程中依旧保留在蛋白随后恢复到初始状态，是通过静息状态和K中间体的差值计算而来。

3、 氯转运的第一步

激活1μs时Cl351位点剥离，作者在PSB与Thr102之间发现一个正差的密度并将其建模为Cl352，此时该位置仍被Cl351部分占据着。这个部分形成的Cl352结合位点因与PSB、π-系统及Thr新形成的80°旋转异构体发生相互作用而稳定。作者通过量子化学计算分析了这些相互作用，发现稳定主要是由氯离子与PSB间的静电作用主导，视黄醛的C14-C15＝N部分也起作用。作者还在视黄醛的π-系统与Cl352间鉴定出一个阴离子-π相互作用，阴离子的负电荷与发色团的π电子密度发生共振，氯离子出现时视紫质PSB静电势图及模拟计算结果也证实偏振的发生。

基于此前报道的HsHR静息状态结构【3】，推测离子可以被移动的PSB“拖动”，但其在视紫质上的路径仍然是未知的。根据本研究获得的数据，当光异构化的视紫质与Cl351之间发生电荷分离时，在微秒内离子跟随PSB产生出一个路径，介于视紫质和C螺旋之间。本研究鉴定出的阴离子-π相互作用似乎是转运过程中一个必需步骤。氯转运的第一步使得离子向细胞质靠近4.0Å。

4、空间分子门控

在静息状态，C螺旋呈扭结并靠近Cl351。当Cl351剥离时，C螺旋上的扭结由静息状态时的38°±6°松弛至光激活20μs时的22°±7°，并会继续松弛，在激活后2.5ms时至最小角度16°±7°。在激活状态下的同源钠离子泵KR2也观察到C螺旋的移动【8】，但彼时并未产生一个明显的扭结。作者推测存在一个中间状态，钠离子被捕获至视紫质和C螺旋间，才会在KR2产生出类似的扭结。在NmHR中，扭结的松弛使得Asn98的侧链移动到不含有氯离子的Cl351位点，推测可作为一种空间关闭分子门控阻止氯离子反向流动。在替代Cl351时，Asn98的侧链仅与水分子Wat484和Wat407发生相互作用；而Asn98骨架上的羧基与Thr102形成一个新的氢键，进一步稳定并封闭该闸门。Thr102位于保守的NTQ基序中，在转运的早期具有多重作用：在静息状态时，与Cl351协调；在1μs时，其侧链通过旋转异构化辅助氯离子转移到Cl352位点；自20μs离子开始向胞内转运时起，Thr102就封闭分子闸门阻止氯离子回流。在KR2中对应的氨基酸残基是Asp116【8】，为阳离子提供一个电驱动力并中和PSB上的正电荷，显示视紫质针对不同底物的进化适应性。

5、 氯离子释放借助于NTQ基序中的Gln109

在激活20μs后，Cl351和Cl352结合位点解离而Cl353可能通过替换水分子Wat485出现在视黄醛之上，这使其在通往胞质的转运通路上进一步前进14Å的距离。Cl353结合位点可以被水分子Wat401和Wat402结合，是由保守基序NTQ中的Gln109及Ser54、Thr243共同构成的。作者还观察到Wat402与Leu106之间存在一个弱的异常信号，但该位点在TR-SFX数据中未能成功建模。Leu106对应在此前发表的NpHR N状态中间体结构中的是Ile134【5】，它需要发生一个构象变化才能参与瞬时氯离子结合位点的形成。

需要指出的是，NmHR的Gln109位于离子泵的战略位置，类似此前发表的细菌视紫质质子外排泵中的Asp96，是席夫碱的内部质子供体【10】；在KR2中，类似碱基是Gln123，参与钠离子的向外转运【8】。以上功能类似的残基表明，尽管转运的离子带有不同电荷、尺寸甚至相反的离子流向，视紫质泵在转运通道上具有某些共有区段。

在最后阶段，氯离子可能是通过表面的Wat482结合位点释放的，该位点形成于激活后300μs，距离Cl353小于8Å。此时伴随着Thr51和Ser40取向的变化，均朝向Wat482。

6、氯离子的吸收

通过主要带负电荷的胞外表面和主要带正电荷的胞内表面，NmHR似乎形成了一个电偶极。电偶极的形成赋予电荷跨细胞膜转运一个额外的驱动力，允许转运可以双向进行。遍布外表面溶液界面的负电荷成为阴离子吸收的障碍，但一个由Asn3封闭的水分子空洞却可借助保守的Arg223正电荷驱动完成吸收。作者在光稳态的SSX数据中鉴定出一个异常色散位点，将其建模为Cl354，可由Arg223、Tyr96、Wat403和Wat404稳定。而保守的Arg95的正电荷可促进氯离子继续通过视紫质。为进一步进入含有Wat409和Wat416的水空洞，阴离子还需通过Gln68，该位点仅在12.5ms出现异构变化。一旦卤素离子扩散入Wat409位点，转运通路就被Asp231阻断。

7、 静电门控允许静息状态的再次充电

作者模拟计算判定只有阴离子状态的Asp231可产生激发能，这与实验结果吻合。Asp231和Arg95间距为2.9Å，两者间存在一个盐桥。当卤离子扩散入Wat409位点后，会干扰上述静电吸引力。作者发现Asp231的侧链构象在22.5ms至37.5ms间会转动，转而与His29而非Arg95发生互作。此时，静电门打开并为卤离子产生一个通向Cl355结合位点的通道，该位置便于Cl355位点的再充电，距离是4Å。在恢复至静息状态之前，静电门控再次关闭，阻止阴离子泄露回外部溶液中。通过这种方式，静电门控保证了定向运输。自12.5ms起，C螺旋的扭结角度开始再次增大，至45ms时，C螺旋到达静息状态构象。通过C螺旋的移动，Asn98的侧链也离开Cl351位点，视黄醛异构回全反式构象。氯离子很可能推动了Asn98侧链的移动并打破静电门控的封闭，其驱动能来自与PSB的强电荷作用。

以上就是本文获得的氯离子通过视紫质转运入胞内所需的结构变化。概括而言，光激活视紫质的视黄醛发生异构变化，储存足够的能量同时暴露出外部的氯离子结合位点；接着，视紫质的Thr102变构，氯离子在视黄醛PSB的“拖动”下开始向胞质移动；与此同时，C螺旋扭结松弛，Asn98的侧链占据空出的离子位点防止出现倒流，Thr102的侧链进一步辅助氯离子向胞质侧移动；借助水分子的作用，氯离子进一步向细胞质移动，最终在Gln109作用下释放入细胞质。视紫质随即再次发生变构恢复至静息状态，准备下一转运过程。此外，由膜内外两侧电荷差异形成的电偶极还允许氯离子双向运输。

原文链接：

https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.abj6663

制版人：十一

参考文献

1、 S. Yoshizawa, Y. Kumagai, H. Kim, Y. Ogura, T. Hayashi, W. Iwasaki, E. F. DeLong, K. Kogure, Functional characterization of flavobacteria rhodopsins reveals a unique class of light-driven chloride pump in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 6732–6737 (2014).

2、 F. Zhang, L.-P. Wang, M. Brauner, J. F. Liewald, K. Kay, N. Watzke, P. G. Wood, E. Bamberg, G. Nagel, A. Gottschalk, K. Deisseroth, Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature 446, 633–639 (2007).

3、 M. Kolbe, H. Besir, L.-O. Essen, D. Oesterhelt, Structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin at 1.8 A resolution. Science 288, 1390–1396 (2000).

4、 W. Gmelin, K. Zeth, R. Efremov, J. Heberle, J. Tittor, D. Oesterhelt, The crystal structure of the L1 intermediate of halorhodopsin at 1.9 angstroms resolution. Photochem. Photobiol. 83, 369–377 (2007).

5、 T. Kouyama, H. Kawaguchi, T. Nakanishi, H. Kubo, M. Murakami, Crystal structures of the L1, L2, N, and O states of pharaonis halorhodopsin. Biophys. J. 108, 2680–2690 (2015).

6、 T. Hosaka, S. Yoshizawa, Y. Nakajima, N. Ohsawa, M. Hato, E. F. DeLong, K. Kogure, S. Yokoyama, T. Kimura-Someya, W. Iwasaki, M. Shirouzu, Structural mechanism for light-driven transport by a new type of chloride ion pump, Nonlabens marinus rhodopsin-3. J. Biol. Chem. 291, 17488–17495 (2016).

7、 P. Nogly, T. Weinert, D. James, S. Carbajo, D. Ozerov, A. Furrer, D. Gashi, V. Borin, P. Skopintsev, K. Jaeger, K. Nass, P. Båth, R. Bosman, J. Koglin, M. Seaberg, T. Lane, D. Kekilli, S. Brünle, T. Tanaka, W. Wu, C. Milne, T. White, A. Barty, U. Weierstall, V. Panneels, E. Nango, S. Iwata, M. Hunter, I. Schapiro, G. Schertler, R. Neutze, J. Standfuss, Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science 361, eaat0094 (2018).

8、 P. Skopintsev, D. Ehrenberg, T. Weinert, D. James, R. K. Kar, P. J. M. Johnson, D. Ozerov, A. Furrer, I. Martiel, F. Dworkowski, K. Nass, G. Knopp, C. Cirelli, C. Arrell, D. Gashi, S. Mous, M. Wranik, T. Gruhl, D. Kekilli, S. Brünle, X. Deupi, G. F. X. Schertler, R. M. Benoit, V. Panneels, P. Nogly, I. Schapiro, C. Milne, J. Heberle, J. Standfuss, Femtosecond-to-millisecond structural changes in a light-driven sodium pump. Nature 583, 314–318 (2020).

9、 T. Tsukamoto, S. Yoshizawa, T. Kikukawa, M. Demura, Y. Sudo, Implications for the light-driven chloride ion transport mechanism of Nonlabens marinus rhodopsin 3 by its photochemical characteristics. J. Phys. Chem. B 121, 2027–2038 (2017).

10、 T. Weinert, P. Skopintsev, D. James, F. Dworkowski, E. Panepucci, D. Kekilli, A. Furrer, S. Brünle, S. Mous, D. Ozerov, P. Nogly, M. Wang, J. Standfuss, Proton uptake mechanism in bacteriorhodopsin captured by serial synchrotron crystallography. Science 365, 61–65 (2019).

转载须知

【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。