Mol Cell | 李姗实验室揭示病原菌通过蛋白质翻译后修饰ADPR-deacylization调控程序性细胞死亡的新机制

许多革兰氏阴性致病菌通过其III型分泌系统（Type III Secretion System，T3SS）向宿主“注入”效应蛋白，来干扰宿主免疫信号通路，从而协助病原菌侵染。紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum，C. violaceum）广泛存在于热带及亚热带地区土壤和水体中，感染人体尤其是免疫力低下的人群可引起严重的皮肤、肝、脾脓肿和坏死，感染进程快，致死率超过50%【1,2】，其毒力依赖于它所拥有的两套Ⅲ型分泌系统：Cpi-1/-1a和Cpi-2 [3]。紫色色杆菌感染巨噬细胞时，其III型分泌系统装置中的针状蛋白CprI可通过激活NLRC4-caspase-1炎症小体引发细胞焦亡【3,4】。但紫色色杆菌与上皮细胞死亡通路之间有怎样的调控关系，此前未有报道。

2022年3月25日，华中农业大学李姗教授实验室在Molecular Cell在线发表题为Pathogen hijacks programmed cell death signaling by arginine ADPR-deacylization of caspases的论文。文章报道了紫色色杆菌III型效应蛋白CopC能作用于宿主细胞多个caspase蛋白（caspase-3/-7/-8/-9），通过一种新型翻译后修饰抑制caspase的蛋白酶活性，从而调控多种程序性细胞死亡。作者在动物感染模型中确定了效应蛋白CopC及其酶学活性对紫色色杆菌的毒力至关重要，为开发防治紫色色杆菌感染相关疾病提供了新的药物靶点和理论基础。同时，这也是首次（注：在这篇论文审稿过程中，NIBS邵峰课题组在Nature发文报道源自痢疾杆菌的III型效应蛋白利用此524 Da翻译后修饰抑制炎性caspase-4/-11，从而抑制细胞焦亡，详见：Nature亮点 | 邵峰/刘小云团队揭示病原菌抑制宿主细胞焦亡的新机制——全新的蛋白质翻译后修饰）报道病原菌效应蛋白能以翻译后修饰的方式作用于凋亡相关caspase蛋白。

研究人员在利用C. violaceum感染上皮细胞并检测细胞死亡相关分子标志物时，发现caspase-3蛋白没有活化成活性的p17形式，而是大量停留在弱活性的p20形式，并且这种caspase-3 p20积累的现象，依赖于其III型分泌系统。研究人员从细菌基因组中克隆了几乎所有已报道的III型效应蛋白，发现只有CopC可以通过抑制caspase-3/-7活性来调控细胞死亡。

研究人员利用caspase-3切割底物GSDME的体外反应体系证明CopC直接抑制caspase-3/-7的酶学活性。有趣的是，这种抑制只特异性发生在真核共表达CopC与caspase-3时，而非原核共表达时。说明存在真核特异性辅助因子帮助CopC发挥功能。作者通过鉴定CopC在宿主细胞中的互作蛋白组并结合功能验证发现钙调蛋白（Calmodulin，CaM）是CopC的辅助因子。在原核表达体系中加入CaM，CopC就可以正常发挥功能了，并且CopC、CaM和caspase-3能形成稳定的三元复合物。

CopC抑制caspase-3/-7活性的机制是什么？仅仅只是通过相互结合吗？答案是否定的，研究人员发现与CopC共表达的caspase-3小亚基蛋白p12电泳条带有明显向上迁移，提示CopC可能是通过翻译后修饰来抑制caspase-3活性。

CopC对caspase-3产生了何种翻译后修饰？是自然界中已发现的还是未发现的？带着这些问题，作者继续进行探索。通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）技术检测发现，与CopC共表达的caspase-3分子量比单表达的caspase-3分子量增加524 Da。作者比对数据库发现524 Da分子量增加是一种此前从未报道过的分子量迁移，说明CopC是通过一种新型翻译后修饰来抑制caspase-3/-7的活性。

接下来，作者通过一系列的摸索，逐步揭开了这个524 Da修饰的神秘面纱。

首先，通过二级串联质谱分析鉴定到caspase-3修饰位点是第207位的精氨酸。通过逐一分析修饰肽段二级质谱碎裂离子，发现了三个ADP-核糖化（ADP-ribosylation）修饰的特征峰。且ADP-核糖基团特异性结合蛋白eAf1521能识别被CopC修饰的caspase-3蛋白。作者将重组表达的CopC、CaM、caspase-3和NAD+进行体外共孵育，重构出了CopC对caspase-3的524.03 Da修饰。经典的ADP-核糖化修饰会让底物蛋白分子量增加541 Da，而CopC使caspase-3的分子量增加是524 Da，这17 Da的差异又是怎么来的呢？

17 Da分子量差异很容易让人联想到脱氨反应（Deamination）。为了验证CopC修饰caspase-3的过程中是否发生了脱氨，作者在体外修饰反应中去测定了氨的生成量。作者发现有且仅有野生型CopC、CaM、NAD+能催化caspase-3产生氨并使其分子量增加524 Da，且氨的生成量（29.51 μM)）和底物caspase-3用量（29.33 μM）相当，说明CopC在体外催化caspase-3产生524 Da 修饰的能力非常高。至此，作者判定17 Da分子量差异确是源于脱氨反应。

接下来的一个问题是ADP-核糖基团到底被转移到caspase-3 R207胍基上哪个氮原子（δ或ω）上。根据精氨酸胍基的结构特征，作者对CopC如何催化caspase-3产生524 Da分子量修饰提出了两种猜想。

为了验证到底是哪种反应机制，作者从反应的中间产物找到了突破口。反应机制Ⅰ和Ⅱ中，ADP-核糖化中间产物的主要区别在于精氨酸是否还保留了完整的胍基（ω氮原子所在氨基是否完整）。1967年的文献中讲到，1,2-环己二酮（1,2-Cyclohexanedione，CHD）可以特异性识别精氨酸胍基基团，能与胍基上两个ω氮原子所在氨基（或亚氨基）发生反应，使其分子量增加94.04 Da。研究人员通过大量的突变体筛选，找到CopC D172E突变体让反应停留在541 Da的ADP-核糖化中间体，进而利用CHD 反应，可鉴别是哪种形式的中间产物。由于541 Da修饰的caspase-3中间体可与CHD发生反应并再次产生94.04 Da分子量的增加，证明ADP-核糖基团是转移至精氨酸胍基的δ氮原子上。

综上所述，CopC催化caspase-3产生翻译后修饰的机制为：在辅助因子CaM的辅助下，CopC将NAD+的ADP-核糖基团转移至caspase-3第207位精氨酸胍基中的δ氮原子上（ADP-ribosylation，+541 Da），核糖的2-OH进攻，使精氨酸脱氨 (Deamination，-17 Da)并环化（cyclization），生成一个含碳、氮、氧的恶唑烷环，最终使得caspase-3的分子量增加524 Da，作者根据反应过程将这一修饰命名为“ADPR-deacylization” 。      

修饰位点R207直接参与caspase-3识别其底物切割序列DEVD，在caspase家族中高度保守，那么CopC能否修饰其他的caspase蛋白呢？作者发现CopC也能修饰凋亡通路中其它caspase蛋白（caspase-7/-8/-9），且修饰位点均是位于小亚基的保守精氨酸。鉴于caspase-3（参与凋亡和焦亡通路）和caspase-8（参与凋亡和坏死通路）处于细胞程序性死亡节点位置，提示CopC可能参与调控多种程序性细胞死亡。针对不同细胞死亡体系设计实验，作者发现，CopC除了可以抑制死亡受体和药物刺激诱导的细胞凋亡，还可抑制caspase-3-GSDME介导的细胞焦亡过程，此外CopC可模拟caspase抑制剂z-VAD的功能，通过抑制caspase-8的活性，在TNF和SmacM刺激下激活细胞坏死。

随后，作者在动物感染模型中证实了CopC对感染毒力至关重要。通过序列比对，作者发现CopC的同源蛋白广泛分布于自然界各种致病菌（如人类致病菌、植物致病菌、海洋动物致病菌等）及非致病菌中，且CopC第172位和第230位天冬氨酸高度保守。在这篇论文审稿过程中，北京生命科学研究所邵峰院士课题组在Nature发文报道源自痢疾杆菌的III型效应蛋白利用此524 Da翻译后修饰抑制炎性caspase-4/-11，从而抑制细胞焦亡（Nature亮点 | 邵峰/刘小云团队揭示病原菌抑制宿主细胞焦亡的新机制——全新的蛋白质翻译后修饰）【5】。这些研究表明CopC/OspC3家族蛋白通过ADPR-deacylization/ADP-riboxanation修饰caspase家族蛋白进而调控细胞死亡信号通路是被病原菌广泛使用的一种新机制。

华中农业大学生命科学技术学院，生物医学与健康学院，李姗教授实验室从事病原感染与免疫分子机制研究，“健康饮食-菌群-免疫”分子机制和人群队列研究，热诚欢迎有微生物学、免疫学、生物化学、结构生物学、细胞生物学、肠道菌群等相关研究背景的博士后加入，携手同行。华中农业大学博士后百川计划提供有竞争力的薪资、住房、子女入学待遇，有意者可直接发邮件至lishan@mail.hzau.edu.cn咨询.

原文链接：

https://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(22)00219-2.pdf

参考文献

1. Batista, J.H. and J.F. da Silva Neto, Chromobacterium violaceum Pathogenicity: Updates and Insights from Genome Sequencing of Novel Chromobacterium Species. Front Microbiol. 8, 2213 (2017).

2. Yang, C.H. and Y.H. Li, Chromobacterium violaceum infection: a clinical review of an important but neglected infection. J Chin Med Assoc 74, 435-41 (2011).

3. Miki, T., et al., Chromobacterium pathogenicity island 1 type III secretion system is a major virulence determinant for Chromobacterium violaceum-induced cell death in hepatocytes. Mol. Microbiol 77, 855-872 (2010).

4. Zhao, Y., et al., The NLRC4 inflammasome receptors for bacterial flagellin and type III secretion apparatus. Nature 477, 596-600 (2011).

5. Li, Z., Liu, W., Fu, J., Cheng, S., Xu, Y., Wang, Z., Liu, X., Shi, X., Liu, Y., Qi, X., et al., Shigella evades pyroptosis by arginine ADP-riboxanation of caspase-11. Nature 599, 290-295 (2021).

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