专家点评Nature | 董浩浩/唐晓迪/张兴/周如鸿合作揭示革兰氏阴性菌外膜桶蛋白的组装及完成机制

点评 | 邓子新（中国科学院院士）、黄亿华（中科院生物物理研究所）、黄志伟（哈尔滨工业大学）

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临床常见病原菌如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌 、鲍曼不动杆菌等均属于革兰氏阴性菌，其特殊的外膜成分是产生高致病性和高耐药性的关键。β-桶状蛋白 (Outer membrane proteins, OMPs ) 是细菌外膜的主要蛋白成分，作为物质交换门户参与细菌膜稳定维持、宿主入侵与定植以及耐药等功能。β-桶蛋白三级结构的正确折叠是其发挥功能的重要条件：新生肽链在胞内合成后被运送到外膜，由外膜 β-桶蛋白整合机器  (β-barrel assembly machinery， BAM ) 帮助折叠成桶型结构并整合到外膜中。这一过程在细菌中非常保守，抑制 BAM 功能可导致细菌死亡，因此被视为最具潜力的新型抗菌靶点。近年，针对 BAM 结构功能的研究成为结构生物学的一个热点。研究发现 BAM 蛋白在不消耗能量的情况下，通过核心亚基 BamA 自身 β-桶的侧向打开，利用 BamA 第一根 β-片层与底物 OMP 的最后一根 β-片层 （信号肽） 相互作用，启动外膜蛋白折叠的动态分子模型。前期的研究揭示了 BAM 整合底物的初始阶段，而有关 BAM 如何完成底物 β-桶的折叠、关闭及释放的分子机制尚不清楚。

2023年4月26日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室董浩浩研究员与唐晓迪副教授团队，联合浙江大学医学院冷冻电镜中心张兴教授团队和浙江大学生命科学学院周如鸿教授团队在Nature 上发表题为 Structural basis of BAM-mediated outer membrane β-barrel protein assembly  的研究论文， 首次捕捉到了BAM与底物 β-桶蛋白 EspP 在外膜折叠整合过程中的多个中间态构象，同时通过体内外功能分析及全原子分子动力学模拟揭示了底物OMP的组装、关闭及释放的全过程，为以此蛋白复合物为靶点的新型抗菌药物研发提供了重要基础。

由于BAM 在体内组装底物的过程很快，因此捕获BAM 整合底物的中间复合物具有极高的挑战性。研究团队在BAM与 EspP互作区域的不同位置引入半胱氨酸，使其在体内自发形成二硫键，成功捕获了 BAM-EspP 不同阶段的复合体，再利用单颗粒冷冻电镜技术首次解析了 BAM-EspP的多种构象，包括双桶打开 （open state） 、预关闭 （ready-to-close state） 、半关闭 （semi-closed state） 和全关闭 （full-closed state） 的四个状态的高分辨率三维结构，展示了 BAM对底物 OMP进行组装的完整动态变化过程 ，阐明了BAM识别、整合及释放 EspP的工作机制 （图1） 。

图1. BAM-EspP 的四个动态中间态冷冻电镜密度图与结构图

该研究发现BAM 的多个结构域发生构象变化，诱发底物 OMP整合过程中各阶段的启动。在起始阶段，BamA β-桶N端的 1链向外侧向打开，使初始EspP肽链C端作用于该链，并作为模版协助底物折叠整合形成整张 β-片层。在预备闭合和半闭合构象中，BamA桶状结构从外开 (outward open) 状态转变为内开 (inward open) 至内关 (inward closed) 状态，该构象变化可通过结合细胞膜张力对相连的底物 β-片层施加内卷动力，使其向内弯卷成桶状结构，并利用类似拉链机制使底物在 1 （第一根） 与 12 （最后一根） 之间形成氢键关闭 β-桶。与此同时，BamA β-桶的N端从与底物 OMP互作的界面逐渐剥离，允许β-桶启动关闭程序，直至双桶完全关闭并分离。通过折叠实验显示底物 OMP 1与12之间形成的所有氢键皆对于底物  桶结构的完整折叠与释放十分重要，但对于BamA-1来说胞内端的氢键更为重要，有助底物识别和启动整个折叠程序。同时，BAM辅助亚基BamB-E与BamA 的周质结构域 （POTRAs） 在胞内形成周质环，在  桶关闭过程中，该周质环同时发生顺时针旋转，其中一些处于POTRA域的连接环随着构象改变与BamA β-桶或辅助亚基产生不同相互作用，推测通过引起  桶 N端构象变化，诱发双  桶的关闭，提出BAM“旋转和闭合”机制，并支持早期提出 的“旋转和入膜”的OMP折叠模型 （图2） 。

图2. 推测BAM 装配底物的工作机制示意图

BamA属于OMP85蛋白超家族，参与从细菌外膜到人类线粒体至植物叶绿体外膜蛋白的组装，其对于 β-桶组装功能在进化上是保守的，这表明这些蛋白具有共同的进化起源和折叠机制。 该研究发现不仅为靶向干预耐药菌提供科学依据，同时对于理解真核细胞双膜细胞器线粒体和叶绿体中 β-桶蛋白的保守折叠与整合机制也具有重要的启发意义。

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室创新班本硕博研究生沈崇榕 、浙江大学医学院冷冻电镜中心工程师常圣海博士、四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室博士后罗庆华、浙江大学生命科学院博士后陈骏为该论文的共同第一作者。

该研究成果还在Nature同期刊受邀发表了题为： “Step-by-step assembly of a -barrel protein in a bacterial membrane  的研究简报 （Research Briefing） 。

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邓子新 （中国科学院院士）

细菌耐药性是当前全球公共卫生领域面临的重大挑战。针对细菌的耐药性，我国先后颁布了《遏制细菌耐药国家行动计划（2016—2020年）》、《遏制微生物耐药国家行动计划（2022—2025年）》，制定加强微生物耐药防控、科技研发等行动措施应对细菌耐药。革兰氏阴性菌是包含致病及耐药最多的一类病原菌，包括肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单包菌等，是临床常见且治疗效果不佳的一类病菌。这些细菌的特点是细胞壁外包裹的糖皮外膜，对于宿主细胞的感染、定植以及引发免疫反应起到了关键性作用，同时也对外界物质包括抗菌药物等具有额外的屏蔽作用，是该类细菌高致病性高耐药性的关键因素。

近些年革兰氏阴性菌外膜形成及维稳的生理机制被作为科研热点而竞相报道，目前国际上普遍认为其是突破革兰氏阴性菌防守的潜在靶点。细菌外膜的主要蛋白皆具有特殊的桶状结构，是该类蛋白行使重要生理功能包括物质传递、宿主入侵及药物外排的关键。外膜桶状蛋白质整合机器BAM参与该类蛋白的折叠及外膜整合程序，是细菌存活必不可少的生理过程，因此可作为潜在抗菌药物靶点。四川大学董浩浩／唐晓迪团队与浙江大学张兴和周如鸿团队通过冷冻电镜解析了BAM折叠底物过程多个中间态的复合物三维结构，通过功能试验、分子动力学模拟及机器学习揭示BAM折叠整合外膜桶蛋白的动态分子机制及重要功能位点。这项工作对于真核细胞线粒体、叶绿体中外膜蛋白的折叠机制的理解提供了重要启发，并为解决临床耐药问题具有重要的推进作用。

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黄亿华 （中科院生物物理研究所研究员）

膜蛋白主要分为α-螺旋膜蛋白和β-桶状膜蛋白两个基本的大类。这两类膜蛋白在二级结构、三级结构以及在细胞内的定位都截然不同，预示着它们插膜生成机理的差异。α-螺旋膜蛋白主要定位于细胞的质膜内，由SecYEG translocon负责插膜生成；β桶状蛋白主要分布于革兰氏阴性菌外膜、线粒体及叶绿体的外膜中，分别由Omp85家族膜蛋白组成的复合体 （BAM, SAM和TOC） 负责插膜生成。过去三十多年来，以美国哈佛大学Tom Rapport教授为代表的科学家采用生物化学和结构生物学手段，对α-螺旋膜蛋白的插膜生成机理已经有了很深入的了解， 但由Omp85家族膜蛋白介导的β-桶状膜蛋白的插膜生成机理还不是很清楚。

在革兰氏阴性菌中，新生的外膜β桶状蛋白由BAM复合物 （BamA, BamB, BamC, BamD 和BamE） 负责插入外膜折叠生成。近年来，对BAM的工作机制已有初步的认识：新生多肽通过保守的β信号被BAM识别，核心功能域BamA β桶在N端侧向打开，使第一根 β 片层β1与底物的β信号的β片层相互作用启动底物的折叠。然而，这一过程将如何继续进行直至完成的分子细节由于缺乏中间态的结构信息并不十分清楚。

四川大学董浩浩团队与浙江大学张兴、周如鸿团队合作，深入探究了BAM折叠整合底物的分子机制，成功捕获了BAM折叠底物OMP的中间态复合物，并通过冷冻电镜技术解析4个高分辨率的中间态构象结构，首次展示了OMP底物从折叠到释放的真实动态过程。BamA通过N端β片层从外开、内开到内闭的构象变化，通过相互作用引导底物进入折叠、内卷、关闭及释放状态。该研究团队发现BamA的周质结构域与脂蛋白BamBCDE所形成的周质盘发生顺时针旋转，是引发BamA发生构象变化并协助底物完成折叠的诱因。通过分子动力学研究模拟，计算该BAM-底物复合物在细胞膜内的动态变化证实所解析构变的生理相关性，并通过定点突变结合折叠实验发现参与底物识别、双桶互作以及双桶关闭释放的重要位点。该工作一方面加深了我们对于BAM协调β桶蛋白折叠整合机制的理解，特别是对于底物β桶后期成熟、关闭及释放的过程机制；另一方面，为抑制BAM复合物功能的抗菌药物研发提供了重要的结构信息。

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黄志伟 （哈尔滨工业大学生命学院/生命科学中心教授）

β-桶蛋白 （OMPs） 是线粒体、叶绿体和革兰氏阴性菌外膜的主要蛋白成分，形成 β-片层的跨膜桶状三级结构，参与众多关键细胞功能。在革兰氏阴性菌中，外膜 -桶蛋白参与细胞内外物质交换，维持细胞膜稳定、信号通路传导、宿主免疫及细菌耐药等功能，是细菌生存的必需蛋白。OMP 整合机器BAM 控制 β-桶蛋白的特殊三级结构的正确折叠，是发挥其细胞功能的必需步骤，因此干预 β-桶蛋白的结构折叠过程，是设计创新抗菌药物的切入点。

四川大学董浩浩、唐晓迪团队联合浙江大学张兴、周如鸿团队近日在Nature 杂志上发表了关于β-桶蛋白折叠机制的研究进展。团队成功捕获了β-桶折叠机器BAM在体内折叠外膜 β-桶蛋白OMP过程中的多动态中间态复合体，通过结构生物学、分子细胞生物学和物理生物学技术完整揭示了BAM蛋白机器的工作模型及桶蛋白OMP的折叠机制。通过冷冻电镜技术解析了在整合过程中，BAM功能亚基BamA与底物EspP双桶的打开 （open state） 、预关闭 （ready-to-close state） 、半关闭 （semi-closed state） 和全关闭 （full-closed state） 的四种状态的BAM-EspP高分辨率结构。通过功能实验、AlphaFold人工智能、分子动力学模拟相结合深度挖掘了BAM识别、组装及释放底物的动态机制，并确定了多个影响蛋白功能的关键氨基酸位点，为之后靶向该蛋白的先导化合物筛选提供了重要的科学依据。

β桶类型的外膜功能蛋白是目前极受关注的革兰氏阴性菌药物靶标之一，被国际媒体认为是对抗耐药菌的致命弱点 （阿喀琉斯之踵，Achilles heel） 。由于其参与细胞重要功能且位于细胞膜外层，针对该靶点开发的药物可直接在胞膜外作用，显著降低耐药突变产生。目前所报道的多肽 Darobactin 以及小分子 MRL-494 都是靶向BAM的潜在抑制剂，可导致细菌生长缺陷，但是其抑制机制和抑制活性还需要进一步的研究证实。与此同时，本论文针对BAM分子机制及功能位点的研究，提供了更多可以开展潜在抗菌药物筛选的靶点，以期开发更多高效且特异性强的多肽或者小分子，实现从基础研究再到临床转化抵抗耐药菌威胁。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-05988-8

制版人：十一

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