专家点评CSC | 高绍荣/欧湘红/刘晓雨/王晨飞合作揭示人早期胚胎发育过程中时期特异性H3K9me3修饰调控逆转座子沉默的机制

点评 | 李静一、汤富酬（北京大学），胡晓瑜、颉伟（清华大学）

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组蛋白H3K9me3修饰，作为异染色质的标志之一，对哺乳动物的胚胎发育和细胞命运决定具有十分重要的作用 【1,2】 。H3K9me3的不完全去除是体细胞克隆胚胎发育阻滞在合子基因组激活 （zygotic genome activation, ZGA） 时期的关键原因 【3,4】 ，而富集H3K9me3的异染色质的过早建立也会严重阻碍小鼠着床前胚胎发育 【5】 。在人类和小鼠的ZGA阶段 （人类主要在8细胞期，小鼠主要在2细胞期） ，大量转座子被活跃转录，其中就包括长末端重复序列元件 （long terminal repeats, LTR） 成员MERVL/HERVL等 【6】 。MERVL/HERVL的时期特异性激活依赖于转录因子DUX，驱使胚胎进入全能性的状态 【7-9】 。由于LTR的转座和自我复制能力对哺乳动物基因组的完整性带来潜在的危害，其表达必须受到严格的调控。高绍荣课题组的前期研究发现在小鼠早期胚胎发育过程中存在由DNA甲基化向组蛋白H3K9me3修饰的转换以实现对LTR的沉默调控 【10】 。此外，也有研究强调在谱系特异性基因启动子区域的H3K9me3修饰对于指导后期细胞命运决定和谱系分化具有重大意义 【2,10】 。然而，受到组蛋白修饰检测技术和人类着床前胚胎材料稀缺的限制，人们对H3K9me3修饰在人早期胚胎发育过程中的重编程机制及功能并不十分清楚。

2022年6月24日，同济大学生命科学与技术学院高绍荣/刘晓雨/王晨飞团队与广东省第二人民医院欧湘红团队合作在Cell Stem Cell杂志上在线发表题为 Stage-specific H3K9me3 occupancy ensures retrotransposon silencing in human preimplantation embryos 的封面研究论文。 该研究利用CUT&RUN技术 【11】 ，描绘了人类着床前胚胎发育过程中组蛋白H3K9me3修饰的动态变化图谱，并揭示了时期特异性H3K9me3修饰在逆转座子上的建立及其功能，发现了可能介导H3K9me3修饰建立的关键调控因子。 值得一提的是来自中山大学中山医学院王继厂课题组与孙逸仙纪念医院王文军教授团队合 在Cell Stem Cell上发表了背靠背类似的工作， 题为 Dynamic reprogramming of H3K9me3 at hominoid-specific retrotransposons during human preimplantation development 的论文， 阐明了H3K9me3依赖性异染色质重塑在人类早期胚胎发育中的功能及其机制（详见BioArt今日单独推送） 。

图1 人类着床前胚胎样品收集示意图

为了探究H3K9me3修饰在人类着床前胚胎发育过程中的动态变化特点，研究人员收集了人MII期卵母细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚期的胚胎，并利用CUT&RUN技术对各时期H3K9me3、H3K4me3和H3K27me3修饰水平进行了检测 （图1） 。与预期相符的是，H3K9me3修饰在人早期胚胎中也是高度富集在LTR区域，并且富集H3K9me3的异染色质是逐渐建立起来的 （图2） 。此外，与小鼠相比，人早期胚胎中存在着相对保守的由H3K9me3介导的LTR沉默调控机制。

图2 H3K9me3修饰在基因组上的分布及其动态变化

研究人员发现，在人的早期胚胎中H3K9me3修饰在LTR区域上的建立是有时期特异性的，这确保了在不同胚胎阶段表达的LTR家族的有序沉默。有趣的是，分析结果显示，在人8-细胞中临时建立的H3K9me3修饰在随后的发育阶段更容易富集H3K4me1和H3K27ac修饰，表明其修饰区域在后期可能转变为增强子，而在囊胚中建立的H3K9me3修饰则更加稳定 （图3） 。

为了研究时期特异性H3K9me3修饰的建立是如何调控的，研究人员根据转录因子的结合位点以及H3K9me3修饰的分布情况预测了可能参与这一调控的转录因子，结果表明，一些经典的与H3K9me3修饰相关的调控因子 （包括TRIM28和KRAB-ZNFs） 可能参与调控囊胚特异的H3K9me3标记的LTR，而激活型转录因子DUX4和其他KRAB-ZNFs则可能参与调控8-细胞特异的H3K9me3标记的LTR （图3） 。由于无法直接在人类胚胎中进行这些调控因子的功能验证，而分析发现小鼠早期胚胎发育过程中恰好也存在着与人类高度保守的时期特异性的H3K9me3修饰的调控，研究人员选择了这些候选因子 （DUX4—8细胞特异性和ZNF808—囊胚特异性） 在小鼠中的同源物 （Dux和Zfp51） 进行分析。借助课题组在之前的工作中构建的Dux基因敲除小鼠模型，研究人员发现Dux的缺失会同时影响卵裂期特异性 （对应于人8-细胞特异性） 和囊胚期特异性H3K9me3修饰的建立，并且可能同时存在依赖或不依赖于Zfp的两种调控LTR表达的方式；另一方面，在小鼠受精卵中进行siRNA注射从而敲降胚胎中的Zfp51后，研究人员发现缺乏Zfp51显著影响了囊胚特异性LTR上H3K9me3的建立，而其他LTR则不受影响。以上结果表明，Dux和Zfp51均可以调控小鼠早期胚胎LTR区域时期特异性H3K9me3的建立，并且精准调控LTR的沉默对正常胚胎发育具有重要意义。

最后，该研究还揭示了H3K4me3/H3K9me3二价结构域在人类植入前胚胎发育过程中是逐步建立的，可能与H3K4me3/H3K27me3二价结构域类似，起到调节谱系分化的作用。

图3 人类早期胚胎发育过程中H3K9me3标记的LTR调控机制模式图

综上所述， 该研究揭示了人类胚胎ZGA和第一次谱系分化过程中的H3K9me3修饰重编程过程，描绘了人类植入前胚胎发育中异染色质重塑的规律。此外，该研究提出激活型DUX4对建立人ZGA阶段的抑制型组蛋白H3K9me3修饰具有重要贡献，为更好地理解生命之初转录因子与组蛋白修饰之间复杂的调控网络提供了新的见解。

值得一提的是，来自耶鲁大学的Andrew Zhuo Xiao对上述工作进行了评述。

本文的第一作者包括同济大学直博生徐睿敏，广东省第二人民医院李森博士，同济大学吴秋博士、李翀博士和广东省第二人民医院蒋满喜博士。高绍荣教授，欧湘红教授，刘晓雨教授与王晨飞教授是本文的共同通讯作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.stem.2022.06.001

专家点评

李静一、汤富酬（ 北京大学生物医学前沿创新中心 ）

着床前胚胎发育的表观遗传调控机制研究一直是发育生物学领域的核心问题和热点问题。然而受限于胚胎细胞数量稀少和取材困难等困扰，很多相关重要科学问题得不到深入的研究。近年来，随着单细胞组学测序技术以及微量样品组学测序技术的进步，使得这些困扰迎刃而解。

高绍荣团队在这一领域厚积薄发，利用微量样品测序技术CUT&RUN刻画了人类着床前胚胎发育过程中关键表观遗传修饰-H3K9me3修饰（组蛋白H3第九位赖氨酸的三甲基化修饰）的动态变化图谱。这一研究使得我们对于人类早期胚胎发育的表观遗传学调控的理解更进了一步，是领域内的重大突破。过去很多相关研究基于小鼠等模式动物，从模式动物中得到的分子调控机制可以非常清楚，但是这些调控机制是否在人类胚胎发育过程中也完全适用，一直是亟待验证的问题。对人类胚胎的直接研究对于我们理解自身发育过程、破解人类发育和相关疾病的秘密至关重要。高绍荣团队的这项研究不仅揭示了人类着床前胚胎发育过程中H3K9me3介导的基因组中长末端重复序列（LTR）的沉默调控机制，还充分利用小鼠模型的优势，深入分析了敲除Dux以及敲降Zfp51这两个调控H3K9me3修饰的关键调控基因的发育表型。该研究的结果表明Dux和Zfp51均可以调控小鼠早期胚胎的基因组中长末端重复序列（LTR）区域的发育阶段特异性的H3K9me3的建立，并通过这一修饰精准调控着床前胚胎的基因组中长末端重复序列（LTR）的沉默，这对于维持早期胚胎中基因组的稳定性和发育程序的稳健性至关重要。

该研究专注于探究人类着床前胚胎发育过程中关键表观遗传修饰的具体调控机制，并充分利用小鼠模型的取材和遗传操作优势，确认了关键调控因子的具体上下游调控路径。该研究不仅能帮助我们更深入地理解人类早期胚胎发育的机理，也启发我们充分利用模式动物的取材和遗传操作优势，精准回答人类发育生物学问题。这是人类发育生物学领域的又一项重要突破，为早期发育异常等相关疾病的诊断和治疗提供了基础。

专家点评

胡晓瑜、颉伟（清华大学）

人类基因组中有接近50％的区域由转座子 （Transposable element，TE） 组成。TE在基因组稳定性、免疫反应、基因调控网络、生物进化等方面都起到了至关重要的作用。在受精后，胚胎会经历合子基因组激活，其中TE会被大量激活，并参与一部分基因的启动和染色质开放性调控。之后TE也需要在合适的时候被抑制。H3K9me3组蛋白修饰是异染色质的典型标志之一，能够调控很多转座子和基因的表达。体细胞核移植胚胎常常会因为H3K9me3未被完全擦除而使合子基因组出现异常。因此了解H3K9me3的动态变化对了解胚胎发育过程中基因和TE的调控至关重要。之前高绍荣/张勇实验室合作揭示了小鼠早期胚胎H3K9me3的动态变化，并发现其对启动子和LTR逆转座子有重要的调控功能  (Wang et al., 2018) 。Torres-Padilla组发现特别早期小鼠胚胎中(1-2C)的H3K9me3可能是不具有抑制性的  (Burton et al., 2020) ，之后H3K9me3逐渐展现出抑制性。但由于人类着床前胚胎的稀缺性，人们对早期胚胎组蛋白H3K9me3的动态变化一直不太清楚。

近日，同济大学生命科学与技术学院高绍荣/刘晓雨/王晨飞团队与广东省第二人民医院欧湘红团队合作，利用CUT&RUN技术，揭示了组蛋白H3K9me3修饰在人类着床前胚胎的动态变化。研究人员发现H3K9me3在人类早期胚胎主要富集在重复序列。与小鼠十分类似，H3K9me3在分裂期 （cleavage）和囊胚期（blastocyst）出现在不同的重复序列上。其中分裂期出现的区域倾向于未来成为开放区域，与调控序列有重叠。作者通过对转录因子结合位点和H3K9me3分布的偏好性进行分析，发现不同的KRAB-ZFPs与不同时期的H3K9me3具有相关性。此外，作者还通过对小鼠中KRAB-ZNFs和Dux进行敲低或敲除，发现这些因子在小鼠胚胎中能够影响H3K9me3的建立。尤其是Dux敲除能够显著影响H3K9me3的分布。不过作者发现很多KRAB-ZFP也发生了下调，所以倾向于认为DUX可能是通过调控KRAB-ZFP间接调控H3K9me3。基于人与小鼠在H3K9me3重编程的保守性，作者推测这些基因可能对人类胚胎中H3K9me3的分布也有类似的调控作用。

有趣的是，人类和小鼠早期胚胎中的组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3的存在形式和重编程模式存在明显的物种特异分布 (Xia et al., 2019)。而H3K9me3和DNA甲基化似乎在物种间的重编程更加保守一些。为什么组蛋白修饰重编程会有这种差别是一个值得未来研究的问题。

总之，作为一种关键的抑制性组蛋白修饰，探索H3K9me3在人类胚胎发育中的动态变化和调控对了解人类胚胎中的表观遗传重编程以及重复序列调控机制具有重要的意义。这项工作沿承了高绍荣课题组和合作团队在小鼠胚胎发育中关于H3K9me3的一系列系统性研究工作，对于我们更好的理解人类早期胚胎发育和生命的起始提供了重要的理论基础。

制版人：十一

参考文献

1. Becker, J.S., D. Nicetto, and K.S. Zaret, H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends Genet, 2016. 32(1): p. 29-41.

2. Nicetto, D., et al., H3K9me3-heterochromatin loss at protein-coding genes enables developmental lineage specification. Science, 2019. 363(6424): p. 294-297.

3. Matoba, S., et al., Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell, 2014. 159(4): p. 884-95.

4. Liu, W., et al., Identification of key factors conquering developmental arrest of somatic cell cloned embryos by combining embryo biopsy and single-cell sequencing. Cell Discov, 2016. 2: p. 16010.

5. Burton, A., et al., Heterochromatin establishment during early mammalian development is regulated by pericentromeric RNA and characterized by non-repressive H3K9me3. Nat Cell Biol, 2020. 22(7): p. 767-778.

6. Macfarlan, T.S., et al., Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity. Nature, 2012. 487(7405): p. 57-63.

7. Whiddon, J.L., et al., Conservation and innovation in the DUX4-family gene network. Nat Genet, 2017. 49(6): p. 935-940.

8. Hendrickson, P.G., et al., Conserved roles of mouse DUX and human DUX4 in activating cleavage-stage genes and MERVL/HERVL retrotransposons. Nat Genet, 2017. 49(6): p. 925-934.

9. De Iaco, A., et al., DUX-family transcription factors regulate zygotic genome activation in placental mammals. Nat Genet, 2017. 49(6): p. 941-945.

10. Wang, C., et al., Reprogramming of H3K9me3-dependent heterochromatin during mammalian embryo development. Nat Cell Biol, 2018. 20(5): p. 620-631.

11. Skene, P.J. and S. Henikoff, An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife, 2017. 6.

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