专家点评Cell | 张宏团队揭示内质网表面钙瞬变决定自噬体在内质网形成

点评 | 刘伟 教授（浙江大学医学院）

细胞自噬是一种溶酶体介导的降解途径。自噬指细胞通过形成双层膜结构的自噬体，包裹部分胞质并运送到溶酶体进行降解及回收的过程，对抵抗各种应激和维持细胞稳态至关重要 【1,2】 。自噬异常与神经退行性疾病等多种疾病的发生发展密切相关。自噬体形成的关键步骤包括隔离膜 （自噬体前体） 的启始、成核、延伸以及闭合。对单细胞酵母中鉴定的一系列参与自噬的Atg基因的研究，促进了人们对自噬体形成分子机制的认识。这些基因编码的蛋白在自噬体形成的不同步骤发挥功能。比如自噬诱导条件下，酵母Atg17/Atg13/Atg1复合物形成凝聚体并定位在液泡膜上，进而招募下游自噬蛋白，促使隔离膜在液泡上形成 【3,4】 。多细胞生物自噬过程远比酵母自噬复杂，包括多个特有的步骤 【5】 。其中一个重要区别在于自噬体形成的位置。自噬诱导下，多细胞生物中参与自噬体起始的FIP200复合物在内质网上形成凝聚体，从而启动自噬体在内质网上形成 【6】 。张宏课题组前期利用建立的线虫遗传筛选模型鉴定了一系列多细胞生物特有核心自噬基因 （epg基因） ，并发现编码的EPG蛋白参与多个多细胞生物自噬中特有的步骤 【7,8】 。

自噬领域中一个长期悬而未决的问题是：酵母或多细胞生物中，决定自噬体在液泡或内质网上形成的信号是什么？

2022年10月4日，中国科学院生物物理研究所张宏课题组在Cell杂志在线发表了题为  Calcium transients on the ER surface trigger liquid-liquid phase separation of FIP200 to specify autophagosome initiation sites  的研究论文 。该文发现： 自噬诱导条件下内质网表面的钙瞬变是决定自噬体在内质网上形成的关键信号。内质网表面的钙瞬变引起FIP200复合物液-液相分离，形成的FIP200凝聚体与内质网膜蛋白结合，定位于内质网并成为自噬体起始位点。

研究者首先发现钙离子快速螯合剂BAPTA-AM可以抑制参与自噬起始的FIP200复合物在内质网上形成凝聚体，但这一过程不能被慢速钙离子螯合剂EGTA-AM阻断。这提示快速的局部的钙离子变化，而非稳态的钙离子浓度变化，可能参与了自噬起始过程。研究人员构建了内质网跨膜结构域CYB5与快速钙离子探针GCaMP6f的融合蛋白，将GCaMP6f定位于内质网外膜表面朝向胞浆侧，以检测内质网外膜表面钙离子浓度的变化。利用多模态超分辨活细胞成像技术 （Multi-SIM） ，研究者发现在饥饿或Torin1处理等自噬诱导条件下，内质网表面发生钙瞬变/钙振荡，且这些钙信号能被BAPTA-AM阻断 （Figure 1） 。

Figure 1. Multi-SIM分析不同刺激条件下钙离子浓度变化的3D曲面图。

进一步研究发现，张宏课题组前期鉴定的内质网定位的新自噬蛋白EPG-4/EI24控制内质网表面钙瞬变/钙振荡的幅值、频率和持续时间。敲除EI24的细胞中，内质网表面出现持续的钙振荡，FIP200凝聚体以及WIPI2等标记的早期自噬结构的数目显著累积。电镜观测发现这些结构显著变小而且不能闭合，提示内质网表面钙的持续增高也影响自噬体延伸及闭合的过程。通过化学试剂处理，或减小内质网表面钙通道的活性，可以降低EI24敲除引起的钙瞬变并拯救其自噬缺陷的表型。

研究发现，自噬诱导条件下，内质网表面发生的钙瞬变/钙振荡触发FIP200复合物发生液-液相分离，形成具有高度动态且易于融合的液滴状FIP200凝聚体 （Figure 2） 。FIP200凝聚体通过与内质网膜蛋白VAPs和ATLs结合，稳定定位于内质网上，并在内质网上移动，与其他的FIP200凝聚体融合。在达到一定大小后，FIP200凝聚体停止融合，成为内质网上的自噬体起始位点，招募下游自噬蛋白，启动自噬体的形成。研究者还发现ATG9囊泡参与调节FIP200复合物的相分离，并调节FIP200凝聚体在内质网上的空间构建。

Figure 2. (A) 内质网外膜钙瞬变触发FIP200复合物发生液-液相分离。(B) 内质网表面的FIP200凝聚体发生融合。

综上， 该研究发现在自噬诱导条件下，内质网表面发生的钙瞬变诱导自噬起始FIP200复合物发生液-液相分离。形成的FIP200凝聚体通过与内质网上的膜蛋白结合而稳定定位于内质网，成为自噬起始位点 （Figure. 3） 。该工作揭示了内质网表面钙瞬变是决定自噬体在内质网上形成的关键信号，极大地促进了我们对多细胞生物自噬分子机制的理解。

Figure 3. 内质网外膜钙瞬变触发FIP200复合物发生液-液相分离，并定位于内质网形成自噬起始位点的模式图。

专家点评

刘伟 （浙江大学 ）

自噬体形成是巨自噬（通常泛指自噬）的标志性事件，相对于单细胞酵母自噬体从附着在液泡膜上的自噬前结构（PAS）生成，多细胞生物的自噬体能在内质网膜的多个位点同时发生，其中FIP200/ATG13/ULK1复合物在这些位点的组装激活是启动最初的自噬膜形成的关键步骤，但自噬信号如何导致ULK1复合物在内质网上特定位点激活这一问题一直未能解决。另一方面，细胞浆中和膜性细胞器局部的Ca2+浓度及其快速动态变化能启动细胞内多种生理活动信号。既往的研究表明，细胞浆中和内质网中储存的Ca2+浓度的改变，能通过影响自噬核心蛋白质机器的活性调控自噬。然而，自噬发生时，细胞内Ca2+信号在空间和时间上的变化特征及其调控自噬的分子机制完全未知。

在张宏实验室的这项极其出色的工作中，他们通过发展新型灵敏的Ca2+传感检测器，发现发生在内质网膜外表面Ca2+的瞬变信号是启动自噬体形成的关键，它能促进FIP200/ATG13/ULK1复合物的组装，而且这种Ca2+瞬变的频率、振幅和持续时间至关重要。他们还鉴定出内质网贯膜蛋白EI24（EPG-4）能与内质网膜上的Ca2+通道蛋白相互作用，通过造成重要Ca2+通道蛋白IP3R在内质网膜上的群集，决定内质网膜表面的Ca2+瞬变。同时，他们还发现溶酶体中Ca2+的释放也参与FIP200复合物在内质网表明的聚集，证明细胞中不同细胞器产生的Ca2+信号在膜接触位点的交互联系。张宏实验室既往在细胞内液相分离的形成和功能研究中有重要发现，阐明了自噬关键转录因子TFEB在核内的液相分离对自噬的调控作用。而且，他们还和胡俊杰实验室合作，鉴定出内质网蛋白VAP和ATL2/3在ULK1复合物在内质网上组装部位决定中的作用。该项研究中，他们进一步证明，内质网膜表面Ca2+瞬变是通过触发形成依赖ATG13的FIP200的液相分离促进ULK1复合物的组装，而VAP和ATL2/3蛋白在其中发挥重要作用。最后，它们发现ATG9囊泡能调节FIP200的这种相分离及其在内质网膜上的空间组织，阐明了ATG9与ULK1相互作用在自噬体形成中的意义和功能。

总之，这是一项极具工作量和涉及多方面分子细胞实验技术的工作，丰富内容、信息量大。不仅回答了Ca2+信号如何调控自噬启动这一领域内长期存在的问题，还明确了ULK1复合物在内质网膜上组装和激活的诸多细节，实为张宏组在继自噬领域众多成果后的又一重要发现，必将得到广泛关注。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.09.001

制版人：十一

参考文献

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3. Nakatogawa, H. (2020). Mechanisms governing autophagosome biogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 439-58.

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6. Karanasios, E., Walker, S.A., Okkenhaug, H., Manifava, M., Hummel, E., Zimmermann, H., Ahmed, Q., Domart, M.C., Collinson, L., and Ktistakis, N.T. (2016). Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nat. Commun. 7, 12420.

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8. Zhao, Y.G., Chen, Y., Miao, G., Zhao, H., Qu, W., Li, D., Wang, Z., Liu, N., Li, L., Chen, S., et al. (2017). The ER-localized transmembrane protein EPG-3/VMP1 regulates SERCA activity to control ER-isolation membrane contacts for autophagosome formation. Mol. Cell 67, 974-989.

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