Mol Cell | 新方法！甲基转移酶DNMT1活性的化学追踪

撰文 | 寒冰

对于生命来说， 通过DNA修饰和染色质结构的可逆性变化对细胞的表型和命运的表观遗传学调控，是生物发育，衰老以及疾病的重要基础。DNA甲基化作为表观遗传机制之一，在哺乳动物中，通常发生于CpG双核苷酸链上，主要是通过DNA甲基转移酶（DNMT）以S-腺苷甲硫氨酸SAM（AdoMet）为供体，将胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶 (5mC) 。其中，DNMT1优先作用于半甲基化CpG位点，并被认为是主要负责维持DNA复制后预先存在的甲基化模式【1】。另外两种主要类型的哺乳动物甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B则没有表现出这样的底物偏好，并被认为是在未修饰的基因组区域的甲基化（从头甲基化）中起主要作用。各种细胞和动物学研究表明这些酶的缺失是致命的，而其对应的一些体细胞突变更与很多疾病相关【2-5】。

近年来对于DNMTs的研究发现，它们不仅“各司其职”，有时也会“相互合作”【6】。然而由于一些方法和技术的瓶颈，每个DNMT催化甲基化发生的准确地点，时间和功能的研究受到了很大的阻碍。其一是分析技术测量出来的一些甲基化信号是所有DNMTs共同作用出来的，所以使得刨析当中每一个DNMT对此的贡献变得复杂。其二是对于每个DNMT功能的推论往往来源于一些间接证据例如基因表达水平，DNMT定位等等，然而DNMTs的活性受到多方面的影响，一些定位或者相互作用的事件可能只是非催化的功能。其三是DNMTs基因敲除会导致基因组大量甲基化不足，从而表现出显著的细胞表型变化，这对DNMTs对细胞行为的影响的结论造成了一定困惑。

为克服这些技术限制，2022年3月3日，来自立陶宛维尔纽斯大学的Saulius Klimasauskas课题组在Molecular Cell上发表题为Selective chemical tracking of Dnmt1 catalytic activity in live cells的文章。通过对小鼠DNMT1的工程设计使其将合成的辅因子类似物的拓展部份催化转移到DNA上，运用CRISPR/Cas9将工程化的DNMT1安插到基因组中，通过控制电穿孔脉冲内化的辅因子类似物，实现在小鼠胚胎干细胞上选择性标记DNMT1作用位点，并且准确绘制DNMT1催化靶点的位置，为上述问题提供了一种新的化学生物学解决方案。

为了搭建这种高分辨率选择性追踪的实验平台，研究人员们需要翻越下面四座实验大山：1. 对可以在DNA上加上可追踪化学基团的生物正交DNMT-辅因子对的工程改造；2. 在选定的哺乳细胞系中通过基因编辑将原DNMT的基因座中的密码子替换成工程过的密码子；3. 将正交辅因子可控的传递到活的工程化细胞中；4. 读取DNMT特异性的化学标记的基因组位置。接下来，作者们为我们细细描述如何将这些决定性问题一一解开。

首先，对于第一个问题，作者们采用了一种化学遗传学里的策略“bump and hole”（指针对蛋白-配体结合位点进行工程改造，使其通过空间互补性实现选择性，同时保持生化能力和与野生型对的正交性）。通过作者之前对甲基转移酶的研究发现，细菌的野生型甲基转移酶对于携带长于四个碳单位的侧链的AdoMet类似物无活性，但它可以通过将辅因子结合口袋中保守的2-3个氨基酸替换成丙氨酸的空间设计来接受更大的基团【7,8】。于是，运用结构引导建模方法，根据之前的X-ray结构【9,10】，作者选择了三个位点进行单位点和双位点突变（Q1230A, R1576A, N1580A, R1576A/N1580A），同时合成了末端带有叠氮基和 6-azidohex-2-ynyl 侧链的配体Ado-6-azide。之后研究人员们通过对酶活性的动力学测定发现野生型DNMT1与AdoMet一起对底物产生了活性，但和Ado-6-azide 一起却检测不到活性。另一方面， N1580A和R1576A/N1580A 突变体在和Ado-6-azide一起的情况下，烷基转移活性显着增强，其产生的 “扩展” 核苷5- (6-azidohex-2-ynyl) -2’-deoxycytidine (N3-5mC) 也被串联MS/MS检测到 （图1）。接下来，研究者们设计了一系列扩展辅因子类似物来检测空间工程化的辅因子口袋的容量。值得注意的是，这两个DNMT1 突变体（N1580A， R1576A/N1580A）在转移携带各种功能或报告基团（包括庞大的生物素部分）的炔丙基连接体方面都非常有效。然而，要实现活细胞中 DNMT1 活性的化学追踪，最关键的问题是在内源性辅因子存在下的情况下，DNMT1是否依然具有对Ado-6-azide的强烷基转移活性。因此，作者通过设计不同的实验参数（AdoMet和Ado-6-azide的不同浓度，比例的混合）比较在AdoMet存在的情况下，DNMT1的突变体选择性结合Ado-6-azide和转移叠氮基己炔基的情况。当存在等量的AdoMet和Ado-6-azide时，两个突变体都能够优先的使用Ado-6-azide。综上实验结果表明，DNMT1对生物正交基团的催化转移可以在内源性AdoMet 和其他哺乳动物细胞内成分存在的背景下实现。以上，第一座大山成功翻越。

图1 DNMT1对半甲基化CpG的催化修饰

虽然DNMT1的缺失在所有分裂的体细胞中都是致命的，但是尽管会有大范围甲基化丧失，小鼠胚胎干细胞还是可以继续存活下去，这为研究DNMT的功能提供了一个绝佳的场所。与此同时，CRISPR/Cas9系统的诞生更是突破了胚胎干细胞难以基因编辑这一困境。于是乎，研究人员们便借助这两个极有利的工具，将最强的突变体DNMT1-N1580A嵌入小鼠胚胎干细胞系（mESC, E14TG2a）中。然而，因为Ado-6-azide不能穿透细胞膜，因此无法在标准情况下从培养基进入细胞内。另外，虽然细胞膜对带电化合物的渗透性可以通过安装专用的膜转运蛋白或通过提供额外的包裹递送化合物来增加，但是这可能会产生显着的不利影响。于是，研究人员们最终选择用电穿孔技术将Ado-6-azide传送到细胞内。经过多次实验尝试，研究者们最终确定了实验方案：在电穿孔Ado-6-azide时将培养基换成无血清的培养基，25分钟后换成正常的培养基再培养1-6小时。通过HPLC-MS/MS的检测发现相比于野生型DNMT1， N3-5mC只存在于N1580A敲入的mESC中，并且在电转后培养3小时后达到峰值。与此同时，这一系列操作并没有对细胞活性造成显著影响。因此，上述实验结果成功的表明合成的辅因子可以通过时间控制的方式被运送到活细胞内，并在 “茫茫人海” 中被工程化的DNMT1一眼识别和利用。这样便只剩下最后一个问题，如何读取出DNMT1特异性催化位置。

在化学合成学中，“Click” chemistry（点击化学）是一类常用于生物偶联的生物相容性小分子的化学反应，这类反应可以将选择的底物与特定的生物分子或报告分子等连接起来，其中最常用的便是铜催化的叠氮化合物与炔烃之间的反应，也是本文中应用到的。在之前的研究中，作者提出了一种新的全基因组分析方法：束缚寡核苷酸引物测序 （Tethered Oligonucleotide-Primed Sequencing, TOP-Seq）【11】。该方法利用”Click“介导的寡核苷酸引物共价连接到N3-5mC， 从而允许在这些内部标记的位点引入DNA聚合酶，并产生相邻区域产物以便测序和基因组精准作图。于是为了追踪DNMT1催化位点，作者应用TOP-seq并发现加工假基因在转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TTS）处存在两个DNA修饰峰。这一结果指出一个尚未报道的现象：这些看似沉默的元素存在着表观遗传调控。为了进一步分离开DNMTs对建立和维持DNA甲基化的贡献，作者接下来将Dnmt1特异性修饰谱与之前通过ChIP-seq获得的mESC中 DNMT3A和 DNMT3B的全基因组结合谱【12】进行了比较。研究人员们发现基因内和启动子CpG岛的甲基化修饰可能需要DNMT1和DNMT3B的贡献。值得注意的是，在LINE和LTR反转录转座子中，DNMT3A1和DNMT3B定位模式与DNMT1活性没有相关性，这表明从头甲基转移酶对ESCs中的 LINE 和 LTR 修饰的影响很弱。

综上，作者为我们展示了第一个能够在几乎天然的条件下对活细胞中特定的DNA甲基转移酶活性进行化学追踪的哺乳动物细胞系统。尽管这个体系应用于具体生物实验研究中还需要一些优化，例如酶与辅因子的浓度，电转强度，标记时间等等，但它为后续解决在发育、衰老和疾病过程中如何建立和维持基因组甲基化提供了新的方法。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.02.008

制版人：十一

参考文献

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