重磅消息 | 王明伟/Vogt/杨德华领衔合作团队解析三个致癌特异性PI3Kα突变体的三维结构

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关键词：华领合作癌

资讯来源：药时代

发布时间： 2022-11-08

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2022年11月8日（北京时间），由复旦大学基础医学院王明伟、美国Scripps研究所Peter K. Vogt和中国科学院上海药物研究所杨德华领衔的合作团队于《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America, PNAS）在线发表了题为“Cryo-EM structures ofcancer-specific helical and kinase domain mutations of PI3Kα”的研究成果。该论文首次报道了人源全长磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K）α亚型（p110α-p85α）的三个致癌特异性突变体（H1047R、E542K和E545K）蛋白复合物的冷冻电镜结构，阐明了突变体诱导PI3Kα产生的局部和整体构象变化，为深入认识PI3Kα突变体致癌分子机制和创制特异性针对突变型PI3Kα的抗癌新药提供了重要的信息。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是由催化亚基p110α和调节亚基p85α组成的异二聚体，通过介导来自受体酪氨酸激酶的信号来促进细胞生长、增殖和凋亡等¹。编码催化亚基p110α的基因PIK3CA是第二种最常见的致癌基因，为过去20年来药物发现的最重要靶点之一。其中超过80％的PIK3CA突变聚集在三个位点上：即位于螺旋结构域（Helicaldomain）的E542K和E545K突变，以及位于激酶结构域（Kinasedomain）的H1047R突变，被称之为“热点突变”。突变体诱导酶活性增强，促进癌细胞的繁殖与生长^2-4。尽管这类激酶的ATP竞争性抑制剂已屡见不鲜，且在其他突变激酶（如表皮生长因子受体）相关肿瘤的治疗上取得成功，PI3K抑制剂的临床开发却进展缓慢，致使改善携带PI3Kα突变体患者的预后成为重大挑战。传统抑制剂能同时抑制野生型和突变型PI3Kα的活性，但由于野生型PI3Kα广泛分布在各类组织器官，其抑制会产生严重的毒副作用，突变型PI3Kα特异性抗癌新药的创制因而成为业界所长期关注的“风口”。虽然在一些未经同行评议的融资文书或会议报告里时有提及，但相关化学结构未见披露，这无疑限制了对这些抑制剂的客观评估和药用挖掘。从结构角度来看，目前已报道了突变体H1047R复合物的晶体结构（PDBIDs：3HHM和3HIZ）⁵，尚无突变体E542K和E545K的相关数据。

参加这项工作的科研人员经过反复优化实验条件，在PI3Kα小分子抑制剂BYL-719的帮助下，获得了颗粒均一且性状稳定的蛋白复合物，应用中国科学院上海药物研究所300kV冷冻电镜拍摄到的清晰图像和后继单颗粒三维重构获得了整体分辨率分别为2.74、2.62和2.77Å的突变体H1047R、E542K及E545K立体结构。结果显示，在整体方面，与其野生型的冷冻电镜结构（PDBIDs：7MYN和7MYO）相比⁶，突变体H1047R显示出广泛的一致性（图1A），而突变体E542K和E545K则展现出p85α与p110α相互作用被破坏及柔性显著增加的ABD结构域（图1B-C）。

图1.A，突变体H1047R的结构模型（上）以及与野生型结构（PDBID：7MYO）对比的Cα均方根偏差值（Root mean square deviation, RMSD）示意图（下）；B，突变体E542K的冷冻电镜密度图以及相应的结构模型；C，突变体E545K的结构模型以及相应的局部分辨率示意图。

突变体H1047R的冷冻电镜结构与已报道的该突变晶体结构大体一致，但在细节上存在差异。前者的显著结构特征是R1047侧链旋转到一个独特的、以前未观察到的位置（图2A），继而产生新的氢键作用。因此，激活环获得了更大的灵活性，有利于增强激酶活性。研究还揭示了iSH2和ABD结构域的特异性旋转（图2B），这可能削弱ABD与激酶结构域以及iSH2、C2与激酶结构域之间的抑制性接触，即降低了p85α对p110α活性的自抑制作用（Autoinhibitoryaction），并可能促进p85与磷酸肽的相互作用。在三维可变性（3Dvariability analysis, 3DVA）分析中^6,7，包含1047突变位置的区域和iSH2-ABD结构域的区域显示出比野生型的相应区域更大的灵活性，这与使用1%FDR confidence map分析显示的额外密度区域较同状态下野生型明显减少，即未解析区域灵活性增加（图2C）的结果一致，为激酶的功能增益（Gainof function）奠定了结构生物学基础。

图2.A，H1047R突变体冷冻电镜中独特的R1047侧链构象；B，与野生型和晶体结构对比，ABD-iSH2结构域发生偏移；C，1%FDR confidence map 显示突变体H1047R（左）和野生型（PDBID：7MYO）（右）额外密度（红色区域）的比较。

在突变体E542K和E545K结构中观察到了相似构象：p85α与p110α解离和ABD结构域均显示出高度的灵活性（图3A），这和野生型PI3Kα与磷酸肽相互作用后观察到的变化非常相似⁶，表明这两个突变体既通过阻止p85结合而降低自抑制作用，又极大地增强p110α上ABD结构域的动态灵活性。此外，p110α的催化核心也发生了显著构象变化，包括C2结构域（残基330-480）、螺旋结构域和激酶结构域（包括ATP结合位点）在内的部分残基出现构象重排（图3B）。E542K的ATP结合位点与E545K几乎相同，表明存在共同的BYL-719结合模式（图3C）。不同的是，突变体E542K通过增强nSH2结构域与调节拱（Regulatoryarch, 残基1011-1050）的相互作用来稳定p110α构象，而突变体E545K则表现出一种不同于上述的新构象（图3D）。

图3.A，突变体E542K和E545K模型的RMSD示意图（以Cα测量）；B，突变体E542K、E545K和野生型（PDBID：7MYO）结构⁶对比显示在C2结构域发生部分偏移；C，突变体E542K、E545K与野生型（PDBID：7MYO）结构⁶中ATP结合位点的比较；D，突变体E542K（左）和E545K（右）在突变位点周围的氨基酸残基构象示意图。

复旦大学基础医学院博士研究生刘晓 和 青年研究员周庆 同为该论文的共同第一作者， 复旦大学基础医学院王明伟讲座教授 、 美国科学院院士PeterK. Vogt教授 和 中国科学院上海药物研究所杨德华研究员 为共同通讯作者。该研究先后获得了国家自然科学基金委员会、国家科学技术部、国家卫生健康委员会、中国科学院‒诺和诺德研究基金和美国国立卫生研究院的经费资助。

据悉，两位审稿人对该文给予高度评价，认为其突破性地报道了三个热点突变体较之野生型结构的所有细节信息，是打开PI3Kα药物发现新篇章的奠基性工作，会被广泛引用。特别是p110α突变体的高精度结构解析将为设计高效选择性抑制剂提供关键路线图，是理解p110α致癌突变分子机制的重要线索。

对于这项新突破， 复旦大学附属肿瘤医院副院长、上海市胰腺肿瘤研究所所长虞先濬博士 表示：

PIK3CA 编码PIK3α的催化亚基p110α，是一种突变率极高的致癌驱动基因，其中结直肠癌、胃癌、乳腺癌和脑癌中PIK3CA突变率高出25%，与患者较差的预后相关，是最重要的致癌基因之一。超过80%的PIK3CA突变出现在E542K、E545K和H1047R这三个热点位置上，是治疗恶性肿瘤的关键靶点。王明伟课题组及其合作团队首次解析了PIK3α三种致癌突变体复合物的三维结构，为理解PIK3CA突变致癌机理和靶向该激酶突变体设计及筛选特异性抑制剂提供了宝贵的结构基础，对临床干预PIK3CA活性和肿瘤精准治疗具有重要的意义。

资深药物化学家、泰励生物科技有限公司联合创始人兼总裁仲伯禹博士 认为：

起始于PI3K的PI3K-AKT信号通路精准地调控着人体内细胞存活、代谢、生长和增殖等一系列生理功能。PI3K变异或者过表达所导致的过度活化能够引起抑瘤蛋白PTEN失活和多种癌症的发生，特别是PI3Kα亚型突变的致癌作用已经广为人知。然而，野生型PI3Kα关键性地调控着细胞的代谢过程，其活性一旦受到抑制，体内血糖和血酯将急剧升高，严重时会危及生命。长期以来，由于缺乏PI3Kα野生型和突变型的蛋白结构信息，人们无法选择性地抑制突变型PI3Kα之活性，而野生型被同时抑制而产生的毒副性严重阻碍了相关药物的研发。

针对近年来PI3K抑制剂频频发生的临床不良事件及吉利德（Gilead Sciences）和因塞特（Incyte）对其已经获得加速批准后药物的撤回，数月前美国食品药品监督管理局（FDA）专门就PI3K抑制剂召开了肿瘤药物咨询委员会（ODAC）会议，要求未来的PI3K抑制剂在申请血液肿瘤适应症时应提供随机对照试验的数据支持，从而极大地提高了此类药物的创新门槛。

王明伟/Vogt/杨德华领衔的合作团队首次解析了PI3Kα三种致癌突变体复合物的三维结构，不仅为研究PI3K的生理功能和突变致癌机制提供了新的理论基础，还为设计更安全的选择性地靶向突变型PI3Kα的新药分子贡献了极为有用的工具。长期困扰抗肿瘤药物研发领域的PI3K亚型选择性，尤其是α亚型中更具挑战性的野生型和突变型精准选择性药物将会在这项成果的启发下找到更快捷的解决方案，该工作的重要突破还能帮助研究人员迅速开发出更加安全高效的PI3Kα突变型高选择性药物，惠及相关肿瘤病人。

冷冻电镜作为近年来涌现出来的颠覆性结构生物学方法，在蛋白质结构解析及与配体结合机理研究上发挥着越来越重要的作用。王明伟/杨德华团队不久前已在2型糖尿病治疗领域的胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）、葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽受体（GIPR）和/或胰高血糖素受体（GCGR）多重激活机理的探索上获得了全球领先的进展，最近又在与肿瘤增殖密切相关的PI3K-AKT信号通路研究方面取得突破性斩获，不仅体现该团队在选择解决新药研发未满足需求上的卓越洞见和结构生物学功力，也彰显出他们对先进技术手段的快速掌握能力和高超的资源利用效率。

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参考文献
1. Fruman D A, Chiu H, Hopkins B D, et al. The PI3K pathway in human disease.Cell, 2017, 170(4): 605-635.
2. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, et al. High frequency of mutations of thePIK3CA gene in human cancers. Science, 2004, 304(5670): 554-554.
3. Samuels Y, Diaz Jr L A, Schmidt-Kittler O, et al. Mutant PIK3CA promotescell growth and invasion of human cancer cells. Cancer cell, 2005, 7(6):561-573.
4. Kang S, Bader A G, Vogt P K. Phosphatidylinositol 3-kinase mutationsidentified in human cancer are oncogenic. Proceedings of the National Academyof Sciences, 2005, 102(3): 802-807.
5. Mandelker D, Gabelli S B, Schmidt-Kittler O, et al. A frequent kinase domainmutation that changes the interaction between PI3Kα and the membrane. Proceedingsof the National Academy of Sciences, 2009, 106(40): 16996-17001.

6. Liu X, Yang S, Hart JR, et al. Cryo-EM structures of PI3Kα reveal conformational changes duringinhibition and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences,2021, 118(45): e2109327118.

7. Hart J R, Liu X, PanC, et al. Nanobodies and chemical cross-links advance the structural andfunctional analysis of PI3Kα. Proceedings of the National Academy of Sciences,2022, 119(38): e2210769119.