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乳酸既是重要的能量来源、参与细胞代谢和信号传导，也是重要的砌块分子，参与细胞内关键生物质合成。它是细胞行使生理功能的过程中不可或缺的一部分，特别是在肿瘤代谢、免疫代谢、神经代谢中发挥着重要的作用。
长期以来，人们一直把乳酸这一代谢物作为活细胞代谢检测的金标准。但是，受限于底层研究工具的发展，以往的研究基本都集中在分泌到细胞外的乳酸上，而无法直接对胞内的乳酸进行定量检测。
实际上，细胞代谢是非常复杂的过程，具有强烈的空间异质性。不同组织器官、不同细胞、细胞内复杂的亚细胞结构（细胞器），每个地方的代谢都不尽相同。
迄今为止，乳酸在活细胞内的代谢仍然处于“黑匣子”状态。在传统手段中，检测乳酸一般通过生化、质谱、电化学等方式，但都因各自的局限性，难以获得细胞内乳酸代谢的深度信息，这无异于“隔靴瘙痒”。
例如，生化、质谱等方法是将细胞裂解后进行检测，这种将样品均一化的手段会破坏样品的内在结构，损失重要的代谢物的空间（位置）信息；电化学方法的测量，只能检测胞外或体液中乳酸的情况。传统手段无法检测到乳酸在时间、空间维度上的分布特性，所得信息含金量较低，这对相关理论的研究造成非常大的阻碍。
图丨杨弋教授（来源：杨弋）
华东理工大学团队以“看到”细胞内乳酸代谢全景为目标，研发出一款新型超灵敏乳酸荧光探针 FiLa，并与上海市第四人民医院团队合作首次揭示了尿液乳酸作为疾病生物标志物的重要意义。该探针荧光亮度的动态变化范围为 1500-2700%，与早期乳酸探针相比提升了 100 倍以上（2 个数量级）。
并且，FiLa 系列探针在多种生物样本（亚细胞结构、细胞、活体组织）及实际临床样本中展示出极高的稳定性、特异性、准确性和灵敏度，可用于实际临床样本的检测与相关药物的筛选，达到真正“产业可用”。
尤其值得关注的是，该团队利用 FiLa 探针发现线粒体中的乳酸水平是细胞质和细胞核中的 5-10 倍，并首次证明了线粒体参与乳酸代谢。这些“意外发现”为改写教科书知识，提供了强有力的证据。
Cell Metabolism 同期刊发的评论文章指出，该研究解决了领域内长期争议的科学问题[1]。审稿人认为，论文中报道的探针有可能成为为数不多的、具有真正影响的遗传编码荧光探针之一。
图丨相关论文（来源：Cell Metabolism）
近期，相关论文以《超灵敏探针揭示了生理和疾病中乳酸代谢的时空景观》（Ultrasensitive sensors reveal the spatiotemporal landscape of lactate metabolism in physiology and disease）为题发表在 Cell Metabolism 上[2]。
华东理工大学副研究员李写博士为该论文第一作者，由华东理工大学药学院、生物反应器工程国家重点实验室、上海市细胞代谢光遗传学技术前沿科学研究基地赵玉政教授、杨弋教授以及上海市第四人民医院王从容主任医生担任论文共同通讯作者。
为改写教科书知识提供强有力证据
广为人知的是，乳酸在细胞浆内通过糖酵解过程产生，并分泌到细胞外参与循环，为其他细胞提供能量与调节因子。然而，细胞内主要的“能量工厂”线粒体内到底是否存在乳酸？这是几十年以来领域内“悬而未决”的科学问题。“传统方法测定线粒体乳酸必须进行线粒体分离，然而分离过程中线粒体乳酸迅速损失，造成了线粒体内无乳酸的假象。”杨弋教授指出。
FiLa 探针由于高灵敏度的特性，可以在活细胞内的不同亚细胞结构直接检测乳酸含量。因此，通过 FiLa 探针能看清活细胞内的乳酸在时间和空间层面上发生的一切变化。杨弋教授表示：“我们发现线粒体中具有非常高浓度的乳酸，并首次证明了线粒体参与乳酸代谢。”
（来源：Cell Metabolism）
为阐释乳酸的代谢调控机制，该团队通过 FiLa 探针，利用化学和代谢调控手段，绘制了亚细胞水平的乳酸代谢图谱。他们发现细胞核内有与细胞浆相近水平的乳酸，而线粒体内的乳酸含量则显著高于细胞浆的乳酸水平。
为证明线粒体中存在乳酸，研究人员做了大量工作。在探索如何用质谱法检测线粒体乳酸时，该团队发现在线粒体分离过程中会迅速丢失乳酸，因此他们在如何分离线粒体方面进行了反复摸索。既要迅速地将线粒体分离出来，又要在纯度很高的前提下，让乳酸尽量保留。
“这种现象也解释了为何前人会一直争论‘线粒体中是否有乳酸’这个问题，其取决于分离线粒体时的手段。如果分离操作速度快，也许还能看到一点乳酸，否则乳酸很快就消失了。”他说。
图丨哺乳动物细胞线粒体高度富集乳酸（来源：Cell Metabolism）
代谢的特点是既快速响应外界环境变化或扰动，又会在很短的时间内恢复稳态以维持稳定的细胞内环境。代谢稳态与应答是细胞行使一切其它高级功能的基础。从这一角度而言，利用遗传编码的荧光探针，才可以实现对活细胞中代谢物的实时动态监测，这是传统低空间分辨率和滞后性的检测手段所无法比拟的巨大优势。
乳酸在活细胞以及亚细胞结构中的代谢过程是一个循环往复的动态，必须使用遗传编码荧光探针才可实现对乳酸含量水平的动态观测。杨弋教授指出，虽然此前已有其他乳酸探针，但由于存在各种不足，它们在活细胞、活体动物上都很难获得如此丰富的信息。从技术手段来看，迄今为止只有 FiLa 探针能做活细胞与活体乳酸代谢全景分析这类研究。
领域内长期纷争的问题“线粒体内是否存在乳酸”在学术界分为两派，“不巧”的是，其中一位论文审稿人的立场和该论文中的结论截然相反。他认为这严重冲击了当前领域内的主流观点，并对此提出了诸多疑问。为此，研究团队通过系列证据，充分、严谨地证明了“线粒体中存在乳酸”这一结论，获得了评审人的最终认可。
有望促进诊断新范式的产生
细胞代谢是生命的基本特征，包括繁殖、发育、神经、免疫等在内的生命活动都与代谢息息相关。代谢失衡是导致人类各种重大疾病的主要原因，例如糖尿病、肥胖症、衰老、肿瘤、心血管疾病等。
因此，对细胞代谢过程的监测，无论是在代谢学科基础研究层面，还是在下游应用场景开发上，都具有很高的价值和意义。而乳酸代谢又是其中最核心的代谢过程之一，一旦乳酸代谢出了问题，不仅会导致各类重大疾病，还有可能会危及生命。
该研究可能引发一系列相关理念、机制上的突破。乳酸不仅是能量代谢的主要参与者，乳酸化也是蛋白质功能调控的重要机制。细胞内乳酸转运新通路和新代谢途径的发现，将带来全新的疾病标志物和药物靶标，给生物医药行业带来重大的影响。
图丨亚细胞乳酸代谢图谱揭示乳酸是感知各种代谢活动的关键枢纽（来源：Cell Metabolism）
FiLa 探针能够帮助药物的发现，催生帮助发现新的乳酸代谢相关的转运蛋白、酶、调控蛋白与 RNA 等重要分子。
在疾病诊断方面，该研究有望促进诊断新范式的产生。目前，体外诊断可通过生化、免疫、核酸分子检测等方式进行，细胞学诊断则以看形态为主。而乳酸探针今后可以“一式两用”，同时适用于包括血液、尿液或干细胞在内的体液和细胞学诊断，并且将细胞学诊断从“看形态”转变为“看功能”。
糖尿病是典型的代谢异常导致的疾病之一，该团队在进行临床应用研究时，首次发现尿液乳酸可作为罕见 II 型糖尿病，即线粒体糖尿病（mitochondrial diabetes mellitus，MDM）的筛查指标。
杨弋表示，虽然医学专家对临床 II 型糖尿病（T2DM）患者进行筛查的必要性已经形成了共识，但是临床上缺乏高依从、有效、低成本地将 MDM 患者区分出来的筛查方式。由于 MDM 患者与 T2DM 患者的用药不同，其筛查难题给病人健康造成很大的隐患。“我们通过 FiLa 探针，对罕见的 II 型糖尿病患者可进行快速筛查，从而实现精准的药物治疗。”
未来，该团队希望能够将 FiLa 探针进行临床推广，帮助医生去鉴别不同的疾病并进行状态监测，进而为患者提供精准用药。据悉，该团队正在积极推进该方向的产业转化。
另一方面，该团队也正在用 FiLa 探针作为预后指标进行药物筛选。“这也意味着，我们可以用 FiLa 探针加速很多乳酸代谢异常造成的疾病的药物开发。”杨弋说。
在先进生物监控技术领域深耕 20 年
开发一款高性能的荧光探针充满挑战，一路走来，杨弋教授团队已在活细胞代谢分析方向已积累了 20 年的深厚经验与 Know-how，理论上能够针对任意代谢物进行相应探针的快速开发。
他在清华大学获得学士与博士学位后，在哈佛大学医学院和波士顿大学医学院先后开展了两段博士后研究工作。2006 年，彼时在哈佛医学院及其附属的 Brigham & Women’s 医院担任生物化学副研究员和医学讲师的他决定回国，加入华东理工大学药学院任教。
结合基础研究与产业应用的技术瓶颈，他经过深入的思考，将活细胞代谢分析作为主要的研究方向。近 20 年来，其课题组在细胞代谢的监测和调控研究方面开展了多方面的研究工作，积累了多种原创底层技术工具，包括光控基因表达系统、代谢物荧光探针、荧光 RNA 等。目前，他担任华东理工大学特聘教授、光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心主任和生物反应器工程国家重点实验室副主任。
图丨杨弋研究团队（来源：杨弋）
杨弋教授带领团队陆续开发了一系列高性能代谢荧光探针，并研发出“高通量”与“全景式”活细胞代谢分析方法。团队发明的一系列特异性地检测细胞内核心代谢物 NAD+、NADH、NADPH 等的基因编码荧光探针 Frex、SoNar、iNaps 与 FiNad，实现了在活体动物、活细胞及各亚细胞结构中对氧化还原代谢的动态检测与成像，并且得到了同行发表于 Nature Methods 的评论文章中的高度评价，被认为“颠覆了氧化还原生物学的研究范式”“唤醒了这个领域的科学家们”[3]。
此次的新研究，更是将领域拓展到糖代谢。在下游应用方面，该类探针不仅能够进行低成本、高灵敏度的体外检测，还可以加速药物筛选和发现。团队曾在 2015 年利用 SoNar 探针发现了有效的广谱的抗癌药物，并揭示了全新的药物作用机制。
此外，他们还构建了系列高性能荧光 RNA，第一次在国际上开发出活细胞实用的荧光 RNA，可追踪活细胞中任何 RNA 的代谢动态，被 Nature Method 评价“为 RNA 的相关研究铺平了道路“。
第二，希望用更有效的方法开发药物。在已开发的强大工具基础上，进一步对更多物质产生的代谢表型进行系统分析，了解所有对细胞代谢造成影响的物质特性，例如化学合成的物质、营养物质等。
现在往往针对单一靶标进行药物筛选，而很多复杂疾病靶标不是很明确，靶向筛药效果有限。该团队希望通过组学的研究形式，利用大数据的积累和人工智能方法为重大疾病提供治疗方案。“不是用一种药物，而是用多种药物组合复方，甚至还包括中药来治疗重大疾病，最终形成全新的疾病治疗范式。”杨弋说。
第三，通过代谢检测发现更多疾病诊断的新方法。代谢组学研究发现，很多的微量分子可以作为疾病筛查、诊断和监测的标志物，但因含量过低和检测方法限制，很难推广至临床实现大规模、低成本、高频次的检测。
杨弋表示：“由于 FiLa 探针高度灵敏可以检测到低含量的代谢物质，而且它相对质谱等手段非常简单，有望在一年内研发出尿液乳酸试剂盒，实现在家庭环境就可方便地进行生化诊断。”
第四，催生高产菌株，提升生物制造的效率。生物制造的核心是高产的细胞株或者菌株，但是往往获得高产的细胞株和菌株，需要非常长的时间。
杨弋指出，通过细胞代谢的监控技术，今后能加速高产菌株的发现。现在我们通过合成生物学，可以一次性制造几亿个菌株，但是要在几亿个菌株里挑出一个最好的菌株，需要非常高通量的分析，现有的技术很难达到，但可以通过单细胞分析技术实现。
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参考资料：
1.CellMetabolism(2022).https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.12.007
