Science | 廖茂富团队报道ATP结合盒转运蛋白家族成员MsbA第一代抑制剂的不同变构作用机制

撰文 | Qi

责编 | 酶美

ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette, ABC）可以执行多种功能，包括导入和导出小分子、介导离子通道开放以及跨细胞膜转运脂质等，其主要包含两个跨膜结构域（transmembrane domains, TMD），负责与底物相互作用并转运底物，以及两个可以结合并水解ATP的核苷酸结合结构域（nucleotide-binding domains, NBD）。在“交替开放”模型中【1】，底物首先被向内开放的转运蛋白识别，随后在 NBD中的ATP结合促进了向外开放状态的转变及底物释放，随后ATP发生水解重置了转运蛋白向内开放的状态。因此，阻碍这种构象转换可直接应用于治疗癌症、调节胆固醇稳态和开发新的抗生素【2】。目前已经开发出诸如ABCB1抑制剂（如Elacridar）和ABCG2抑制剂（如MZ29）在内的人类ABC转运蛋白小分子抑制剂，并通过结构研究揭示它们的作用机制。然而，对于大多数其他小分子抑制剂的结构了解仍然很少，因而限制了合理设计靶向ABC转运蛋白药物的能力。

MsbA是一种可以研究ABC转运蛋白机制的模型系统，能在革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）生物发生中起重要作用。目前已经报道了两种类型的MsbA抑制剂，分别是能阻止LPS转运但可以刺激MsbA ATPase活性的TBT1，另一种是能阻止ATP水解和LPS转运的G化合物。但是这两种药物的抑制机制尚不清楚，尤其是TBT1所诱导的ATPase活性与底物转运的解偶联，也就是这两种抑制药物对ATP水解产生相反影响的原因令人费解。

近日，来自美国哈佛大学医学院的廖茂富教授团队在Science杂志上发表了一篇题为Distinct allosteric mechanisms of first-generation MsbA inhibitors 的文章，该团队利用单粒子冷冻电镜和功能测定，揭示TBT1和G247结合MsbA跨膜域中相邻但独立的口袋，两个TBTI分子不对称地占据底物结合位点，导致内向构象缩紧和NBD间距缩小，而两个G247分子在MsbA向内开放状态下对称增加NBD间距。总之，这两种MsbA抑制剂的不同作用机制提供了对ABC转运蛋白药理学的重要见解。

首先，该团队对鲍曼不动杆菌MsbA进行表达纯化，在POPG纳米圆盘中完成蛋白重构，并使用单粒子冷冻电镜来确定TBT1结合的MsbA结构。未结合TBT1的MsbA表现出宽口向内开放的构象，结合TBT1的MsbA的中央底物结合口袋相对于前者，以及E.coli来源的MsbA而言均更为收缩。在TBT1结合后，NBD间距急剧下降，且两个NBD不对称定位，其中一个ATP结合位点更加收紧，从而促进NBD二聚化和ATP水解速率，对TBT1结合引起MsbA ATPase活性刺激提供了直观的解释。

图1. 三种不同来源或状态下的MsbA构象

针对MsbA特异性结合和运输LPS的结构基础已经阐明【3】，在这里，该团队发现MsbA对LPS和TBT1的识别具有惊人的相似性，TBTI的羧基类似于LPS葡糖胺上的磷酸基团，两者都与MsbA形成静电相互作用，对R72A、K290A或两者兼备的MsbA突变体进行重构和功能测定，结果强调了静电作用在TBT1结合中的重要性。但与真正配体不同的是，TBT1能通过破坏域交换螺旋束的稳定性来破坏同型二聚体MsbA的对称性，这也是TBT1对ATPase活性和底物转运解偶联的发生机制。那么模拟底物结合是否可以成为为所有ABC转运蛋白开发小分子调节剂普遍适用的策略呢？该团队还对TBTI诱导拟合口袋进行了计算机化学库筛选，并对选中化合物进行一系列ATPase活性刺激以及结构分析。

除了TBT1之外，G化合物也是一类MsbA特异性抑制剂，但不同的是，G化合物阻碍ATP水解功能。为了进一步解释造成这种差异的原因，该团队也同样获取G247结合的E. coli MsbA冷冻电镜数据，与先前预期不同，并非将NBD推向二聚化界面，G247的结合使得NBD对称但彼此远离，间距增加约13 Å，这预计会引起NBD二聚化效率和ATPase活性降低。

图2. 与G247结合的E.coli MsbA构象

总的来说，这项研究解释了同为MsbA抑制剂的TBT1和G247如何在同时阻碍LPS转运的同时，对ATP水解产生相反的变构效应。考虑到TBT1和G247目前的临床应用仍存在严重缺陷，对于结合化合物的ABC转运蛋白的结构分析为药物开发提供了必要支持。此外，尽管TBT1仅对鲍曼不动杆菌MsbA起作用，但未来可以将这种抑制机制扩展到其他革兰氏阴性细菌中的MsbA的分子。

原文链接:

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abi9009

制版人：十一

参考文献

1. D. C. Rees, E. Johnson, O. Lewinson, ABC transporters: The power to change. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10. 218-227 (2009).

2. S. Shukla, S. Ohnuma, S. V. Ambudkar, Improving cancer chemotherapy with modulators of ABC drug transporters. Curr. Drug Targets 12, 621-630 (2011).

3. W. Mi, Y. Li, S. H. Yoon, R. K. Ernst, T. Walz, M. Liao, Structural basis of MsbA-mediated lipopolysaccharide transport. Nature 549, 233-237 (2017).

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