哺乳动物细胞可广泛应用于重组蛋白、单克隆抗体以及疫苗等生物制品的生产。近年来生物药市场需求量激增，特别是新冠疫情加深了对疫苗和抗体药物的现实需求，高产量、高质量、低成本的哺乳动物细胞灌流培养工艺顺势成为生物制品行业普遍关注的热点。本文围绕细胞培养基选择、培养工艺（特别是灌流培养工艺）、微载体培养、篮式反应器培养和全悬浮培养等展开论述，综述了近年来在哺乳动物培养工艺开发和优化上取得的进步和提出的策略，旨在为生物制品行业哺乳动物细胞培养技术的开发提供参考。
近年来生物药占据的市场份额发展更为迅猛，仅单克隆抗体便占去2017年年度十大畅销药中的8个名额，且年度销售额高达1230亿美元。随着近年来市场上对生物药物需求量的持续增长，特别是新冠病毒疫情持续流行加强了生物药物收益大幅度提升空间，更是在全球范围内掀起了哺乳动物细胞培养的热潮。
目前用于工业化生产的哺乳动物细胞株主要有中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、仓鼠胚肾细胞(BHK)、小鼠骨髓瘤细胞(NS0和SP2/0)，还有一些人类细胞株，包括HEK293和HT-2080。其中对CHO细胞株的研究最为充分，应用最为广泛。2014年~2018年，约84%批准的单抗药来源于CHO细胞。值得注意的是，中国科学院微生物研究所和安徽智飞龙科马生物制药有限公司联合研发重组新型冠状病毒疫苗也是采用的CHO细胞表达生产，该疫苗是首个获批的国产重组新冠病毒蛋白疫苗。
图1. CHO-K1株细胞（图来源于ATCC，https://www.atcc.org/products/ccl-61）
维持细胞在体外正常的生长、增殖需要为其提供适宜的生长环境，其中培养基是细胞生长所需营养物质的主要来源，而其他各种试剂，包括一些盐平衡溶液、消化液、pH调整液等，对细胞培养体系的维持也必不可少。细胞培养基是动物细胞培养中不可缺少的部分，但是培养基的种类很多，对于不同的细胞类型及其研究目的，采用合适的培养基进行细胞培养才能起到很好的效果。哺乳动物细胞常见类型及培养基种类汇总见表1。
注：BME:Basal Medium Eagle；DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium；FBS: Fetal Bovine Serum；IMDM: Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；MEM: Minimum Essential Medium；NEAA: Non-Essential Amino Acids Solution.
哺乳动物细胞体外培养较之传统的微生物培养难度较大，主要是由于哺乳动物细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对外界环境敏感性强、对营养要求苛刻，且培养过程中细胞状态容易改变。目前常用的哺乳动物细胞培养工艺有：批次培养、补料批次培养和灌流培养，见图1。
（注：A批次培养工艺、B补料培养工艺、C灌流培养工艺,；图：张琼琼等,2020）
与传统的批次培养相比，基于哺乳动物细胞灌流培养技术在产物产量、质量及成本等方面表现出来的显著优势，见表2。灌流培养工艺存在的特有之处及工艺优化应着重关注的地方有：❶灌流新鲜培养基，灌流速率的大小调节；❷放流多余细胞，放流速率的大小调节；❸灌流工艺培养周期较长，细胞活率的维持和产量的提高；❹细胞截留装置，细胞的高效截留和产物的高效滤过。
微载体是一种新兴的大规模细胞培养技术，是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法。微载体以微小颗粒作为细胞贴附的载体，可提供相当大的贴附面积，由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使得细胞悬浮在培养液内，最终能够使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术。具有均相培养兼具平板培养和悬浮培养的优势、培养条件（温度、ｐＨ、二氧化碳浓度等）容易控制并且培养过程系统化、自动化、不易被污染。
（图有改动，来源于制药业：https://pharm.vogel.com.cn/c/1178/1178363.shtml）
微载体工艺是一种目前已经应用相对成熟的贴壁细胞培养模式，可以让贴壁细胞做到近似于悬浮培养，而微载体培养想要实现灌流工艺就必须结合ATF或Spin filter等截流装置使用；而传统的搅拌桨配合Spin filter的培养模式，虽然可以将载体与细胞截流在反应器内，但长时间培养搅拌桨产生的剪切力会影响细胞生长并产生碎片载体，且一旦载体投放量或细胞密度较大难免发生堵塞。
Eppendorf的Cell lift搅拌桨与传统搅拌模式不同，其独特的设计将气泡与微载体及细胞进行隔离，并通过离心力和压差的方式进行传质，确保微载体及细胞不受剪切力的影响。灌流时与Cell lift搭配使用的截流装置—decanter可通过微载体与培养基的密度差进行载体细胞的截流。Cell lift与decanter 的搭配，整套装置无需任何耗材，不仅可以实现最高25g/L的微载体投放量，同时可以最大程度的减小灌流的成本，见图3。
图3. Cell lift（提升式）搅拌桨（图源Eppendorf）
篮式反应器又称固定床生物反应器，通过固定床（内有填充材料，聚酯切片disk载体，简称片状载体）使培养基循环，细胞长在填充物的表面或内部。液体循环过程中流经床层，细胞被截留在载体中，其剪切力低，对细胞损伤小，通过分批或连续灌流的方式，可延长细胞培养的时间。
篮式反应器与微载体反应器之间最本质的区别是支撑细胞贴壁生长的载体不同：微载体为葡聚糖实心球形，细胞仅能在表面生长，需依靠搅拌保持悬浮运动状态，而搅拌带来的剪切力会影响细胞的生长因此微载体反应器的转速不宜过高。片状载体（Fibra-Cel disk）是一种固体支持基质，供哺乳动物及昆虫细胞生长，主要用于分泌产物（如重组蛋白及病毒）。
然而，篮式反应器的独特设计带来诸多优势的同时，也带来了该类反应器不能直接取样观察细胞状态、细胞在线消化实现反应器规模放大的局限和技术瓶颈，特别是，片状载体是蜂窝状的高密度生长体，如采用传统消化方法，需持续40-50分钟，大部分细胞因过度消化而死亡，细胞团聚，无法实现逐级在线放大。
图4. 篮式反应器（固定床生物反应器）（图源：Eppendorf）
Eppendorf 的篮式搅拌桨配合片状载体使用，可将细胞捕获在片状载体组成的固定床上，搅拌桨与气泡不会与细胞进行直接接触，避免了剪切力的伤害；片状载体可观的比表面积为细胞生长提供了充足的生长空间，以Vero细胞为例细胞生长密度可高达40×106Cell/mL。由于细胞被捕获于固定床上，在培养时可方便快速的进行去血清换液，也可以在没有任何截流装置的情况下进行灌流培养，见图5。
图5. 篮式搅拌桨和片状载体（图源：Eppendorf）
全悬浮培养是指细胞自由悬浮于培养液内生长增殖的一种发酵方法。目前该项技术发展较快，已逐渐趋向成熟，是当前国际上生物制品生产的主流模式。此工艺优点是操作便捷、产率高、易放大，悬浮细胞可以在反应器中直接生产增殖，细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低；缺点是技术较为复杂、产物回收量大、培养液利用率低。悬浮发酵工艺适于许多工程细胞，例如CHO、 HEK293、杂交瘤、SP2/0、NSO等。
当前动物细胞大规模发酵工艺中的主流方向是搅拌式悬浮连续发酵工艺，特别是抗体等大规模蛋白表达。在工业化生产中，悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其他发酵系统更易理解和掌握。通常，一个好的细胞发酵平台可适用于多种不同重组蛋白或抗体的大规模表达，选择适宜的平台技术可有效减少工艺研究过程的时间。贴壁细胞培养的传统方法是采用转瓶、堆积床和悬浮微载体培养，转瓶和堆积床培养的放大生产受到很多的限制，而悬浮微载体培养是目前疫苗生产经常采用的一种形式。非传统的贴壁细胞培养选用气升式细胞发酵系统、膜透析生物反应器和填充床灌流培养等。
图6. 搅拌气升式生物反应器示意图（图:席仁荣等,2008）
细胞全悬浮培养工艺由于工艺相对简单且易放大，受到众多制药企业的青睐。为方便工艺开发人员的使用，例如Eppendorf可提供从0.3~40 L不同搅拌及通气方式的一次性硬质罐体，可完美衔接后续用于生产的更大规模的一次性反应袋。而对于缺乏丰富放大经验的研究人员而言，怎样进行放大或采取什么样的策略进行放大，必然会成为一道难题，Eppendorf针对这一难点在反应器中增添了“放大助手”软件，可以帮助使用人员进行放大策略的选择以及给出相关参考数值，见图7。
图7. BioFlo 320生物反应器 + 放大助手软件（图源：Eppendorf）
BioFlo 320生物过程控制台旨在提供一个通用平台，以满足生物技术和制药科学各阶段不断变化的需求。占地面积极小并且功能齐全，可配合包括篮式搅拌桨、cell lift搅拌桨在内的多种搅拌系统，适用于从微生物发酵到细胞培养，从纵向扩展到横向扩展，或从批次到流加的生物过程。
越来越多获批上市的生物药物使用灌流培养工艺、全悬浮培养进行生产。基于哺乳动物细胞生物反应器灌流培养单位工作体积高产量、高质量、低成本的显著优势，近年来随着生物药物市场的逐步扩大，工业界和学术界普遍关注灌流工艺的开发和优化，FDA也极大地鼓励生物药物生产工艺由传统的批次培养转型到灌流培养。业界内如Eppendorf的Cell lift搅拌桨、篮式搅拌桨、片状载体、BioFlo 320生物反应器等在全悬浮培养或者灌流培养工艺应用越来越受到生物制药行业的青睐。
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