九大RNA研究热点方向中的最新应用进展

    Promega RiboMAX™ Systems可生成的高质量RNA转录本可直接用于体外或体内翻译。客户可以修饰DNA序列，将DNA快速地转录为RNA，再通过RNA的翻译确定DNA修饰所造成的影响。同样，编码目标蛋白的DNA序列也可被快速转录为mRNA，然后包装进选定的表达系统中，用于治疗或疫苗接种研究。也可与经过修饰的核苷酸和cap类似物兼容，并可用于生产经过标记的RNA探针。

      体外转录系统的特点比较见下表：

      生物体内的mRNA通过RNA编辑和剪接进行调控。如果这些过程中发生错误，则会引起蛋白表达改变或RNA突变，从而导致神经系统疾病、癌症或其他疾病。为了了解这些过程，往往需要通过使用经过标记的RNA探针，如RNA电泳迁移率变动分析（REMSA），来研究蛋白质和RNA之间的相互作用。

    例如，Tang等人利用RiboMAX™ Large Scale RNA Production System生产经过标记的RNA探针，研究RNA编辑和剪接机制之间的串扰及在癌症中的作用（1）。作者利用经过标记的RNA探针，通过REMSA和体外UV交联检测证实了蛋白质和RNA之间的相互作用。

      嫁接是一种园艺技术，将一种植物的芽或枝条与另一种植物的砧木连接，引起表型变化，产生味觉或抗病性的变化。产生这种效应的部分原因是在嫁接物间长距离转移mRNAs从而调节植物生长。RNA结合蛋白及其所形成的核糖核蛋白（RNP）复合物可促进mRNAs的转移。

    为了更详细地研究RNP复合体，Wang等人使用T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System制备经过生物素标记的mRNA，用目标RNA结合蛋白（RBP）进行REMSA（2）。作者得出结论，当mRNA结合一个以上的RNP时，RNP复合体的稳定性增加，RNP的不同组合也会影响稳定性。

      Leigh综合征是一种可导致精神和运动技能丧失的遗传性神经退行性疾病，患者通常在几岁时即死亡。导致这种疾病的遗传因素很多，其中之一就是线粒体DNA的突变。Yamada等人使用RiboMAX™ Large Scale RNA Production System研究mRNA作为线粒体DNA相关Leigh综合征治疗药物的潜在可能性（3）。作者发现，包裹在脂质体载体中的体外转录mRNA减少了病变细胞线粒体中的突变RNA数量。

      为了进行CRISPR/Cas9基因编辑，需要一种引导RNA（gRNA）将Cas蛋白“引导”到所需的DNA修饰位点。体外转录正在成为创建这些引导RNA的常见选择。如有需要，客户可以轻松地将DNA模板克隆到PCR克隆载体，如pGEM®-T Easy，或任何其他选定的载体。

      Bai等人利用T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System生产长gRNAs以测试一种新的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法，该方法可用于在斑马鱼中引入精确突变（4）。使用长单链DNA模板的新方法，能够更高效地引入准确的点突变，并可在斑马鱼中建立人类疾病模型。

       互补DNA（cDNA）文库可用于研究基因表达和蛋白质的相互作用，使客户能够寻找新的基因。cDNA文库常用于在原核宿主中研究真核基因和蛋白质。如需制备cDNA文库，客户要从mRNA开始。获得这种mRNA的一种方法是通过生物体或特定目标基因的体外转录，然后再进行逆转录以创建cDNA文库。体外转录允许客户选择目标基因组的特定片段或序列，故优于其他方法。

      Fujimori等人开发了一种结合二代测序（NGS）的高通量无细胞mRNA显示方法，用于探索蛋白质相互作用组网络（5）。使用RiboMAX™ Large Scale RNA Production System (SP6)生成的mRNA可用于制备无细胞方法的cDNA文库。

      已知6种冠状病毒中的4种可引起世界各地的普通感冒。其中，严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）病毒可引起严重的、致死性疾病（6）。

      利用T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System，Madhugiri等人转录出大量的、高质量的人冠状病毒RNA，用于引物延伸的RNA结构探测（7）。这使得他们能够分析和可视化RNA二级结构。采用突变的病毒DNA进行的生物信息学和体内实验，他们确定了病毒复制所需的三个茎环结构，并且这些结构在种属间高度保守。

       白斑综合征病毒（WSSV）被认为是对虾类养殖业最具威胁的严重传染性病原体。这种病毒的毒力高，致病性强，对虎虾、大西洋白虾等对虾造成的潜在死亡率高达100%。目前，还没有治疗这种病毒的方法。WSSV的非结构蛋白VP9疑似与病毒基因组的复制、病毒颗粒的产生和宿主细胞功能的抑制有关。然而，VP9在体内的功能尚不十分清楚。

      Alenton等人利用RNAi研究感染WSSV的对虾宿主与病原体的相互作用（8）。RNAi涉及利用双链RNA（dsRNA）沉默相应基因的表达。使用T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System生产VP9的dsRNA和对照靶基因。作者发现，沉默VP9提高了对虾的病毒清除率和总存活率。

       根据CDC的数据，美国50%的肝癌病例是由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的（9）。HCV是一种可致癌的RNA病毒，该病毒可被筛查，并且大部分可用抗病毒药物治疗。已证明多种致癌DNA病毒能使p53肿瘤抑制蛋白失活，但HCV影响p53的机制尚不清楚。

      Mitchell等人使用T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System从复制缺陷型对照质粒中转录HCV基因组长度的RNA（10）。将转录的病毒RNA电转到允许HCV复制的HepG2细胞中、引起病毒感染。从而研究p53蛋白和其他相关蛋白在HCV感染细胞中的作用。结果表明，p53的抑制实际上是由宿主对病毒RNA复制的反应——蛋白激酶R（PKR）的激活引起的。PKR的这种激活一般会减少所有蛋白质的合成，包括p53，进而抑制DNA损伤反应。

       慢性髓性白血病（CML）是一种影响造血干细胞的疾病，可引起异常血细胞不受控制的增殖。一种治疗选择是使用酪氨酸激酶抑制剂进行靶向治疗。治疗期间，必须监测患者的微小残留病变（MRD），确认进展并避免复发。监测MRD最灵敏的方法是使用实时qPCR进行分子检测。

      Kitamura等人开发了高灵敏度的MRD实时qPCR检测方法，使用T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System生产检测用RNA标准品（11）。新的检测方法快速且易于操作，使其可应用于医院实验室和其他低通量场景。