靶向钙敏感受体的变构药物研发进展

CaSR(Calcium-Sensing Receptor，钙敏感受体)在人体内广泛表达，尤其在甲状旁腺和肾脏中大量存在。在这些组织中，CaSR负责细胞外Ca²⁺的精确控制，以保持全身游离的Ca²⁺浓度在1.2–1.4mM之内。CaSR会因Ca²⁺浓度的升高而负调节甲状旁腺激素(Parathyroid hormone, PTH)的分泌。在肾脏内，CaSR会对浓度升高的Ca²⁺作出独立于PTH的反应，进一步降低Ca²⁺的重吸收。当前，CaSR发现在甲状旁腺功能亢奋，高钙血症，骨质疏松等疾病中发挥重要作用，并筛选优化获得多种通过变构调节CaSR功能的活性分子，部分分子已经进入用于治疗上述疾病，还有部分分子正处于临床前和临床研究阶段。

从信号通路上看，CaSR通过对G_i/o蛋白的激活抑制腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase, AC)，从而降低了cAMP的水平。同时，CaSR与G_q/11蛋白偶联会激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(Phosphoinositide-specific phospholipase C, PI-PLC)，从而增加三磷酸肌醇(Inositol Triphosphate, IP3)和二酰甘油(Diacylglycerol, DAG)的水平，并触发贮存的Ca²⁺的释放。进而，释放的Ca²⁺激活磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)和PKC(Protein kinase C)。另外，CaSR可通过L型电压门控和瞬时受体电势离子通道(Ion channel, IC)中Ca²⁺的流入来增加Ca²⁺水平。此外，CaSR还通过G_q/11蛋白介导的PKC，G_i/o蛋白介导的表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)激活和β抑制蛋白，来激活MAPK信号级联反应。

从结构上看，CaSR蛋白是由7个外显子编码，表达为1078个氨基酸的7次跨膜受体蛋白。其中，第2-6个外显子编码大的细胞外结构域(Extracellular domain, ECD)，第7个外显子编码七次跨膜(7 transmembrane, 7TM)区域和C末端尾巴。研究发现，CaSR由共价和非共价的相互作用介导形成同源二聚体发挥功能。在ECD中，包含了一个双叶“捕蝇草”(VFT)结构域，之所以这么称呼是因为其两个叶(分别称为LB1和LB2)可以围绕配体结合的裂隙打开和关闭，就像捕蝇草在猎物周围关闭一样。VFT通过一个富含半胱氨酸的结构域(Cysteine-rich domain, CRD)连接到7TM及其连接的胞内和胞外loop环(分别称为ICL和ECL)上。7TM的结构完整性部分由ECL1中的C677和ECL2中的C765之间的二硫键保持。7TM衔接着一个大的C末端尾部，这有助于细胞表面的表达，信号传导以及与辅助蛋白的结合。

CaSR的内源性配体及其结合位点

Ca²⁺是CaSR的主要生理性配体。X射线晶体学结合散射分析表明，Ca²⁺会以协作的方式与VFT结构域内的四个位点结合，即Ca²⁺与其中一个位点的结合会促进Ca²⁺与其他位点的结合。有证据表明，Ca²⁺在缺乏整个ECD的CaSR上仍保留了激动剂活性，因此可以推测Ca²⁺还与7TM或ECL中的至少一个位点结合。因此，虽然Ca²⁺被认为是正构激动剂，但严格来说Ca²⁺是其自身的变构调节剂。除了Ca²⁺之外，CaSR还可响应其他二价阳离子如Mg²⁺，以及三价阳离子如Gd³⁺。

    CaSR的VFT裂隙(VFT cleft)是内源性正向变构调节剂(Positive allosteric modulators, PAM)的结合位点，例如芳香族L-氨基酸和γ-谷氨酰胺肽，特别是L-苯丙氨酸和L-色氨酸，是CaSR上最有效的PAM。X射线晶体学解析的CaSR VFT结构表明，仅当裂口被L-氨基酸或类似的实体占据时，才会产生具有完全活性(closed state, 闭合状态)的VFT构象。其他带正电荷的内源性配体也会通过CaSR的变构位点发回活性，例如精胺，亚精胺和腐胺。

CaSR的外源性PAM分子及其变构位点

研究发现钙离子通道阻断剂芬地林(fendiline)和普尼拉明(prenylamine)可以靶向作用于CaSR，在此基础上优化产生了CaSR的新型芳基烷基胺类PAM，包括NPS R-467, NPS R-568, calcimimetics, evocalcet，calindol及其衍生物等。这些芳基烷基胺类PAM可以增强重组细胞中CaSR介导的Ca²⁺转移，或在存在生理Ca²⁺浓度的情况下抑制甲状旁腺细胞的PTH分泌，但在没有Ca²⁺的情况下其效力或亲和力则会降低。

    2010年，Acadia制药公司发现了苯并噻唑类的CaSR PAM，其结构和化学性质均不同于芳基烷基胺类PAM，并优化开发出了AC265347。AC265347在不存在阳离子的情况下也表现出变构激动剂活性，且它的活性比芳基烷基胺类PAM更高效。特别的是，AC265347还是一个有偏向性的的CaSR变构调节剂，相对于Ca²⁺转移，它优先增强CaSR介导的ERK1/2磷酸化(pERK1/2)。对接研究表明，与芳基烷基胺PAM相比，AC265347在7TM中心的位置更深，这使得AC265347可以稳定不同的CaSR构象状态，从而产生偏向性的CaSR信号传导。

CaSR的多肽型PAM维拉卡肽(Etelcalcetide)

除了小分子型的PAMs， 还发现了多肽型CaSR PAM，如维拉卡肽(Etelcalcetide)。作为一种八肽，它由七个D-氨基酸组成的线性链通过二硫键与L-半胱氨酸相连产生。据预测，Etelcalcetide是通过与VFT-LB1中的“铰链”区域附近的C482形成二硫键，从而与CaSR-VFT结合，介导VFT的关闭。在缺乏Ca²⁺的情况下，HEK293细胞中的Etelcalcetide活性显著降低，但仍能保留激动剂活性，因此它是一种PAM激动剂。

CaSR的外源性NAM活性分子及其变构位点

NPS制药公司通过高通量筛选和药物化学改造发现了第一个CaSR NAM(Negative allosteric modulators)——NPS2143，其结构特征具有芳基烷基胺骨架。随后对芳基烷基胺NAM进行的临床研究发现了几种与NPS2143结构和化学性质相似的NAM，包括ronacaleret，JTT305（也称为MK3552）和NPSP795。根据对接模型，芳烷基胺类NAM很可能与芳烷基胺类PAM作用于CaSR同一7TM腔内，但具体模式还需进一步的结构生物学研究，来阐明两者对CaSR的结构和功能的差异性调节。
    除了芳基烷基胺类NAMs外，诺华公司也发现了一个含喹唑啉酮类的CaSR NAM化合物，并进一步优化得到ATF936和AXT914。与NPS2143相比，ATF936具有更大的负协同作用，这意味着它能更好地阻断CaSR活性。突变和对接研究表明，含喹唑啉酮的NAMs可以与芳基烷基胺类PAMs和NAMs不同的方式在7TM变构腔中结合CaSR。

CaSR的PAM/NAM模式切换变构活性分子

Calhex231是从基于CaSR PAM calindol的SAR研究中发现的。出乎意料的是，calhex231过去被报道为NAM，因为它可以抑制Ca²⁺的最大有效浓度。但是，最近的研究工作表明，calhex231 的功能可以在PAM和NAM中进行切换，取决于它是占据CaSR二聚体中的一个还是两个。calhex231的结合位点与cinacalcet、NPS2143和其他芳基烷基胺类PAM和NAM的结合位点重叠，其模式切换的结构基础主要是来自于其中的二取代环己烷环。

CaSR变构调节剂的临床适应症研究

1. CaSR PAM用于治疗甲状旁腺功能亢进症

CaSR在负调节PTH分泌中的关键作用。原发性甲状旁腺功能亢进症(Primary hyperparathyroidism, PHPT)通常由甲状旁腺腺瘤或癌引起；继发性甲状旁腺功能亢进（Secondary hyperparathyroidism, SHPT）通常是由于在慢性肾脏疾病中，磷酸盐排泄和肾脏1，25-二羟维生素D3合成受损导致Ca²⁺减少，随后引起PTH合成和分泌增加以及甲状旁腺增生。目前，市场上有3种用于治疗甲状旁腺功能亢进症的CaSR PAM。

    2004年，西那卡塞（Cinacalcet/Sensipar）作为第一个在获得FDA批准的CaSR靶向药物，用于治疗慢性肾病引起SHPT的血液透析患者。Cinacalcet也是第一个获得FDA批准的GPCR变构调节剂。尽管大约30%的患者发生胃肠道不良反应，包括恶心、呕吐或食欲不振，但总体上看，Cinacalcet通常是安全且耐受性良好的。

    2017年，FDA批准依替卡西肽（Parsabiv）用于治疗成人SHPT的静脉注射用CaSR PAM。与口服西那卡塞相比，静脉注射依特卡塞可减少胃肠道不良事件，但服用依特卡塞或西那卡塞的SHPT患者自我报告的恶心和呕吐症状无显著差异。

    最近，Evocalcet（替代名称MT-4580和KHK7580）被批准用于对cinacalcet治疗无效的日本SHPT患者。与cinacalcet相比，Evocalcet具有更高的生物利用度，因此需要更低的剂量来抑制血清PTH水平。在人类中，Evocalcet在上消化道症状方面提供了良好的短期耐受性，同时仍然提供与cinacalcet类似的治疗效果。

    虽然所有三种经临床批准的CaSR-PAMs均能有效降低甲状旁腺功能亢进症患者的PTH水平，但低钙血症的风险和胃肠道副作用的发生率限制了它们在临床上的应用。因此，仍然需要具有更少副作用的新型PAMs。

2. CaSR PAMs用于治疗高钙血症

家族性1型低钙血症（Familial hypocalciuric hypercalcaemia types 1, FHH1）和新生儿严重原发性甲状旁腺功能亢进（Neonatal severe primary hyperparathyroidism, NSHPT）是由CaSR突变失活引起的。这些突变降低了CaSR对Ca²⁺的敏感性，或损害了内质网或高尔基体内CaSR的生物合成和翻译后处理，导致CaSR错误折叠和细胞表面表达受损。FHH1的特征是血清钙和镁轻度或中度升高，PTH水平轻度升高或正常。虽然FHH1患者通常无症状，但高达30%的患者会出现症状性高钙血症，而其他患者发展出软骨钙质沉着症、急性胰腺炎和胆结石。

    在CaSR突变引发的功能丧失或表达缺失的患者中，cinacalcet在治疗NHSPT以及与FHH1相关的并发症方面越来越成功。然而，有越来越多的报道称NSHPT患者对cinacalcet反应不充分，这可能是由于纯合子突变导致CaSR在7TM中的cinacalcet结合位点之前被截断，也可能是存在错义突变或框内缺失，导致表达的全长CaSR具有单一氨基酸突变或被缩短，从而降低了cinacalcet的亲和力或通过降低变构协同性增强了Ca²⁺的能力。

    有趣的是，与cinacalcet相比，AC265347在增强某些CaSR突变的Ca²⁺介导的信号反应方面更有效。然而，由于AC265347在临床上尚未被批准，目前仍需要对当前药物干预无反应的患者进行甲状旁腺全切术，以使其血清甲状旁腺素水平正常化。

3. CaSR NAMs用于治疗骨质疏松症

NPS2143是第一个在切除卵巢的绝经后骨质疏松大鼠模型中进行评估的CaSR NAM。然而，在NPS2143给药5周后，并未观察到骨量和密度的净增加。而且NPS2143的大量分布导致NPS2143暴露时间延长，PTH水平持续升高，这会模拟甲状旁腺功能亢进，从而以牺牲骨形成为代价刺激骨吸收。

    Ronacaleret是第二个在骨质疏松症中被评估的CaSR NAM。尽管ronacaleret在结构上与NPS2143相似，但其代谢更不稳定。由于AXT914对骨形成标志物缺乏作用以及治疗四周后血清钙的剂量限制性增加，AXT914的临床试验也提前终止。

    CaSR-NAMs不刺激骨形成的原因尚不完全清楚，但可能与甲状旁腺外细胞和组织中靶向CaSR效应有关。例如，CaSR-NAMs可能抑制CaSR在成骨细胞中的重要作用，从而抵消PTH瞬时释放的影响。此外，虽然ronacaleret、JTT305和AXT914的药代动力学特征比NPS2143更有利，但NAM介导的血清PTH浓度升高在人体内持续超过基线3.5小时。不管临床上CaSR-NAM失败的原因是什么，用于骨质疏松症的NAMs的开发已经停止，而人们的努力已经集中在将CaSR-NAMs重新用于替代性疾病上。

4. CaSR NAMs用于治疗ADH和Bartter综合征Ⅴ

Ⅰ型常染色体显性低血钙（Autosomal dominant hypocalcaemia type 1, ADH1)是由CaSR突变引起的，Bartter综合征V则是由CaSR突变或ADH2（GNA11突变）引起。ADH的特点是血清钙和PTH浓度轻度或中度下降。在更严重的情况下，功能获得性CaSR突变会促进肾钠、钾、镁和氯离子的丢失，从而导致低钾性碱中毒和高肾素性醛固酮增多症，这些症状被称为Bartter综合征V.

    NPS2143有望在体外使由ADH引起的CaSR和GNA11突变相关的信号反应正常化，以及增加ADH1和ADH2小鼠模型中的Ca²⁺和PTH浓度，并预防小鼠的肾钙质沉着症。但是，NPS2143在体外在纠正导致Bartter综合征的CaSR突变方面的效果较差。相比之下，喹唑啉酮衍生的NAM（例如AXT914和ATF936）在体外可以更好地纠正Bartter综合征V突变，并且可能代表一类与芳烷基胺衍生的NAMs（如NPS2143）相比，受药物遗传学效应影响倾向较低的NAMs。

    虽然最初是为骨质疏松症开发的，但是芳基烷基胺衍生的NAM，NPSP795已进入治疗ADH1的II期临床试验。NPSP795在5例ADH1试验患者中有3例显著增加了PTH，并导致肾Ca²⁺排泄量的轻微减少。然而，NPSP795对血清Ca²⁺水平没有显著影响，对PTH的影响也不同，其原因尚待确定。

5. CaSR NAMs用于治疗哮喘

哮喘在全球范围内影响着约3.4亿人，尤其对大约10%的哮喘患者(其目前的药物无法有效控制哮喘)构成严重的健康风险。CaSR在支气管平滑肌和上皮中表达。最近，CaSR被认为是治疗哮喘的一个潜在靶点。在哮喘患者的支气管活检组织、小鼠哮喘模型和暴露于哮喘相关细胞因子的人气道平滑肌细胞中，CaSR表达上调，这可能是通过CaSR基因启动子中的STAT和κB反应元件来实现的。CaSR NAM NPS2143减弱了对乙酰胆碱或组胺反应的人气道平滑肌细胞中的Ca²⁺释放，提示在哮喘中对抗CaSR信号的潜在益处。在过敏性呼吸道疾病的小鼠模型中，CaSR-NAMs的长期治疗可减轻气道炎症、纤维化和气道对毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂乙酰甲胆碱的高反应性（Airway hyper-responsiveness, AHR）。最近的研究结果表明，在慢性气道炎症模型中，NAMs ronacaleret、JTT-305、NPSP795和AXT914都能减轻气道炎症，并防止杯状细胞增生。

总结与未来展望

CaSR是一种多模式的跨膜化学传感器，其可通过不同变构位点对多种外源性和内源性刺激作出反应。尽管人们已经对靶向CaSR的治疗做出了巨大的努力，但到目前为止，只有CaSR PAMs进入了临床。尽管CaSR NAMs有望作为ADH的治疗方法，但仍需确定患者对NAMs反应的潜在差异性的原因，以促进此类化合物的开发。因此，关于CaSR NAMs是如何与受体结合，以及自然发生的突变是如何改变NAMs的结合和功能，我们还有很多要了解。

参考文献

1. Diao J, DeBono A, Josephs TM, Bourke JE, Capuano B, Gregory KJ, Leach K. Therapeutic Opportunities of Targeting Allosteric Binding Sites on the Calcium-Sensing Receptor. ACS Pharmacol Transl Sci. 2021, 4(2):666-679. 

2. Leach, K., Hannan, F. M., Josephs, T. M., Keller, A. N., Møller, T. C., Ward, D. T., Kallay, E., Mason, R. S., Thakker, R. V., Riccardi, D., Conigrave, A. D., and Bräuner-Osborne, H. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. CVIII. Calcium-sensing receptor nomenclature, pharmacology, and function. Pharmacol. Rev. 2020, 72, 558−604.

3. Kantham, L., Quinn, S. J., Egbuna, O. I., Baxi, K., Butters, R., Pang, J. L., Pollak, M. R., Goltzman, D., and Brown, E. M. The calcium-sensing receptor (CaSR) defends against hypercalcemia independently of its regulation of parathyroid hormone secretion. Am. J. Physiol. 2009, 297, E915−923

识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！

请注明：姓名+研究方向！

版

权

声

明

本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。