Nature | 丁一倞/Caroline Dean合作解析COOLAIR体内单分子RNA结构构象，发现其对开花时间的调控功能

责编 | 王一

长链非编码RNA （lncRNA）在生物体生长发育及疾病产生等过程中发挥重要调控作用。近些年来，越来越多的研究表明lncRNA的二级结构可以顺式或反式作用来调控染色质的状态进而影响基因的表达。细胞内同一个基因的转录本，包括lncRNA，在加工过程中会产生不同的可变剪切产物；另外，即便是序列相同的可变剪切产物，在体内也会形成不同的RNA结构构象，因此，细胞内的lncRNA在序列和二级结构上存在高度的异质性（heterogenous）。这些异质性导致研究人员无法准确区分lncRNA不同的可变剪切产物的功能。

在拟南芥开花过程中，一系列统称为COOLAIR的反义lncRNA （antisense lncRNA），可以通过调控关键开花抑制基因FLC的表达而影响植物的开花时间。COOLAIR 在体内存在丰富的加工形式，根据3'端加工情况可以分为两类：一类是比较短的proximal COOLAIRs，也称为Class I COOLAIRs；另外一类是比较长的distal COOLAIR，或称为Class II COOLAIRs，其中每一类都存在不同的可变剪切产物。之前的研究表明，不同的COOLAIR可变剪切产物在温暖和寒冷的条件下，以不同的调控机制影响FLC基因的转录。比如，proximal COOLAIRs通过自主开花途径（autonomous pathway ）影响植物在温暖条件下的开花时间 【1】 ；distal COOLAIRs的某些特异可变剪切产物可以通过与转录激活因子FRIGIDA相似的途径 【2】 ，或者通过促进FRIGIDA凝聚体形成来调控FLC的转录 【3】 ，进而影响拟南芥在春化过程中对低温的响应。

为了解析不同COOLAIR 可变剪切体的RNA二级结构在体内可能存在的功能，2022年8月17日，英国约翰英纳斯研究所丁一倞研究组在Nature上发表了文章 In vivo single-molecule analysis reveals COOLAIR RNA structural diversity 。研究人员发了一种基于单分子测序（PacBio）的体内单分子RNA二级结构解析的方法，称为smStructure-seq（single molecule-based RNA structure sequencing）（图1a）。基于该方法，研究人员可以同时获得体内同一个基因不同可变剪切产物的单个RNA分子的结构信息。同时，研究人员开发了一个对应smStructure-seq的分析方法，称为DaVinci（Determination of the Variation of RNA structure conformation），可以准确拆分序列相同的RNA分子的构象组成。

研究人员最终 发现不同的COOLAIR可变剪切产物具有不同的、处于动态变化的RNA二级结构。 Proximal COOLAIRs 可能由于参与了R-loop的形成，碱基的accessibility总体比较低 （ accessibility 是用来衡量RNA每个碱基在体内的暴露程度，比如RNA-RNA配对和RNA-DNA配对都会导致accessibility降低） 。与之相对，丰度最高的distal COOALIR 的可变剪切产物 Class II.i，在温暖的条件下存在三种不同的构象 （图1） ，且受低温诱导，其中的两种构象比例发生变化，同时有一种新的构象产生。 COOLAIR RNA 分子结构的多样化及其对温度变化的响应，可能反映了其参与的转录调控过程的复杂性。

图1. COOLAIR ClassII.ii在温暖条件下存在三种不同的构象。

通过比较不同构象之间的差别，研究人员发现了一个COOLAIR构象高度可变区域（hyper-variable region），且该区域与FLC mRNA转录起始位点（TSS）所在区域反向互补。研究人员通过遗传设计所获得的改变该区域结构的突变植株具有与野生型不同的FLC表达水平和开花时间，证明COOLAIR RNA的结构对其发挥功能的重要性。为了进一步阐明COOLAIR二级结构调控FLC表达的可能机理，研究人员通过ChIRP实验比较了野生型和突变体中COOLAIR对FLC位点染色质的结合能力，发现早花的突变体中，开放的hyper-variable region使得COOLAIR具有更强的染色质结合能力，从而导致FLC表达下调。这与对酵母和人的研究发现一致，lncRNA在染色质上结合可以抑制基因的转录活性。

综上，该研究首次解析了长非编码RNA COOLAIR体内单分子RNA结构构象并发现对其开花时间的重要调控功能，是高等植物非编码RNA及发育调控研究中的里程碑式进展。本文中开发的单分子RNA结构解析方法及DaVinci分析方法将对解析其他RNA分子体内结构构象并开发相应的分子诊疗方法提供重要的技术参考。

据悉， 杨鸣雷 博士和 朱盼 博士为文章的共同第一作者； 丁一倞 研究员和 Caroline Dean 院士为文章的共同通讯作者； Jitender Cheema 博士、 Rebecca Bloomer 博士、 Pawel Mikulski 博士、 刘奇 博士和 张月莹 博士也对此研究做出了重要贡献。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05135-9

参考文献

1，Xu, C., Wu, Z., Duan, H. C., Fang, X., Jia, G., & Dean, C. (2021). R-loop resolution promotes co-transcriptional chromatin silencing. Nature Communications, 12(1).

2，Li, P., Tao, Z., & Dean, C. (2015). Phenotypic evolution through variation in splicing of the noncoding RNA COOLAIR. Genes and Development, 29(7), 696–701.

3，Zhu, P., Lister, C. & Dean, C. Cold-induced Arabidopsis FRIGIDA nuclear condensates for FLC repression. Nature 599, 657–661 (2021).

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