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R-loop（R环）是细胞内普遍存在的动态三链核酸结构，在 DNA 复制与修复、染色质与转录调控、端粒维持、介导CRISPR以及长非编码核糖核酸（lncRNA）基因组定位中发挥着重要作用【1-4】。R-loop由 DNA-RNA 杂合双链和被 RNA 链局部置换的单DNA 链组成，普遍存在于细菌、真核生物和病毒基因组中，分别覆盖了人类、酵母和拟南芥基因组的 5%、8% 和 10%。近年来的广泛研究揭示了R环的形成、生物学功能和调控，并为其胞内检测提供了新的工具。大多数对R环检测，富集，和分析的方法，例如 DRIPc-seq，依赖于 S9.6 单克隆抗体对 R环的免疫检测，由于该抗体特异性结合 DNA-RNA 杂合链【5-8】。然而，尽管已经广泛使用了二十多年，目前仍不明确 S9.6 对不同类型的双链核酸有多少选择性，是否具有内在序列特异性和偏好，以及其选择性结合杂合链的分子基础。
2022年3月28日，美国国立卫生研究院（NIH）研究员张金伟研究组 (https://www-mslmb.niddk.nih.gov/zhang/zhanglab.html)与NIH Stephen Leppla研究组 在Nature Communications杂志上联合发表文章 Structural basis of R-loop recognition by the S9.6 monoclonal antibody，解析了首个S9.6抗原结合片段 (Fab) 以及S9.6结合DNA-RNA杂合链的复合体共晶体结构，首次揭示了S9.6单抗特异辨识R-loop杂合链的分子基础，并通过荧光偏振、圆二色性、等温滴定量热、差示扫描量热、多角度光散射等多种生物物理手段描述了S9.6结合各种双链核酸的结构与序列特异性。
研究人员首先比对了S9.6抗原结合片段对双链RNA，双链DNA，以及DNA-RNA杂合链的结合能力， 发现S9.6具有明显的特异结合杂合链的能力。尤其在同时存在两种双链的竞争环境下，相对双链RNA，S9.6 对相同序列的杂合链表现出了超过100倍的选择优势，然而对双链DNA没有明显结合。为了阐明S9.6特异结合杂合链的分子基础， 研究人员解析了S9.6与DNA-RNA杂合链的复合体的共晶体结构。
结构分析表明S9.6 不对称地识别杂合链里的RNA 和DNA 链，并直接辨识6个碱基对。S9.6主要通过辨认两个连续核糖的2'-羟基以实现对RNA链的识别，并通过结合主链磷酸和脱氧核糖基团以实现对DNA链的识别。识别主要由 S9.6 抗体重链的芳香族和碱性残基介导，并密切跟踪杂合链小沟 (Minor Groove) 的化学环境和曲率。研究人员比对了S9.6和RNase H辨识DNA-RNA杂合链的机理的共性和区别【9, 10】。最后，通过测量S9.6对不同序列杂合链的亲和力， 研究人员发现S9.6对结合G/C含量高的序列有明显的偏好。这一序列偏好可能部分影响了以前利用依赖S9.6的技术手段对基因组R环分布的准确测绘。
整体而言，这项工作揭示了 S9.6 单抗特异识别 R 环的分子基础，详细说明了S9.6结合不同种类双链核酸的结构和序列特异性，并提供了一种新的不同于RNase H的识别杂合链的策略。此项工作帮助我们进一步了解核酸结构的免疫原性，并为 S9.6 的蛋白质工程改造提供了初始框架。
此项研究工作主要由NIH张金伟实验室博士后Charles Bou-Nader 完成。张金伟研究员和Stephen Leppla 研究员为共同通讯作者。
张金伟研究员简介：
张金伟课题组（https://www-mslmb.niddk.nih.gov/zhang/zhanglab.html）长期致力于复杂非编码核糖核酸的结构生物学前沿研究，主要开发和使用RNA设计和改造，RNA晶体学，冷冻电镜，X 射线自由电子激光，单分子荧光以及荧光寿命等多种生物物理和生物化学技术。张金伟研究员本科毕业于北京大学生命科学学院，在美国威斯康星大学获得博士学位，实验室位于美国国立卫生研究院 （NIH）主校区（Bethesda，Maryland）分子生物学实验室。研究工作主要发表在Nature, Cell, Mol Cell, Cell Host & Microbe, Nat Struct & Mol Biol, Nat Commun 等国际著名期刊（插入BioArt报道链接见下）。课题组长期邀请对RNA结构生物学和生物物理有兴趣的学者加盟团队或者探讨课题和合作。
近期BioArt 报道
Cell Host & Microbe | 张金伟团队合作发现宿主tRNA调控HIV Gag膜定位的结构机制
NSMB | 张金伟/赵华组共同揭示T-box核酸开关的核心机理
NSMB | 张金伟组阐明T-box核酸开关辨识tRNA和调控蛋白质合成的结构机制
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-29187-7
参考文献
1. Thomas, M., R.L. White, and R.W. Davis, Hybridization of RNA to double-stranded DNA: formation of R-loops. Proc Natl Acad Sci U S A, 1976. 73(7): p. 2294-8.
2. Crossley, M.P., M. Bocek, and K.A. Cimprich, R-Loops as Cellular Regulators and Genomic Threats. Mol Cell, 2019. 73(3): p. 398-411.
3. Garcia-Muse, T. and A. Aguilera, R Loops: From Physiological to Pathological Roles. Cell, 2019. 179(3): p. 604-618.
4. Niehrs, C. and B. Luke, Regulatory R-loops as facilitators of gene expression and genome stability. Nat Rev Mol Cell Biol, 2020. 21(3): p. 167-178.
5. Chedin, F., et al., Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. EMBO J, 2021. 40(4): p. e106394.
6. Boguslawski, S.J., et al., Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. J Immunol Methods, 1986. 89(1): p. 123-30.
7. Sanz, L.A. and F. Chedin, High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nat Protoc, 2019. 14(6): p. 1734-1755.
8. Phillips, D.D., et al., The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. J Mol Recognit, 2013. 26(8): p. 376-81.
9. Nowotny, M., et al., Crystal structures of RNase H bound to an RNA/DNA hybrid: substrate specificity and metal-dependent catalysis. Cell, 2005. 121(7): p. 1005-16.
10. Nowotny, M., et al., Structure of human RNase H1 complexed with an RNA/DNA hybrid: insight into HIV reverse transcription. Mol Cell, 2007. 28(2): p. 264-76.
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