​PNAS | 许兴智/彭斌团队发现先天性小头畸形相关蛋白ASPM调控复制叉稳态的新机制

先天性小头畸形 (Congenital Microcephaly， MCPH ) 是一种罕见的常染色体隐形遗传病，大脑结构相对正常但大脑皮层尺寸小，头围相对于其年龄与性别要小三个标准差以上，且伴随神经发育迟滞和不同程度的智力障碍 【1,2】 。截止目前发现致病基因约有25个 （MCPH1-25） ，其中 MCPH5 基因突变最为常见 （约占40%） 。这些基因的无义突变或移码突变产生无功能的蛋白是小头畸形的潜在原因 【2,3】 ，但是，其分子机制不甚明了。 MCHP5 基因编码的蛋白也叫 ASPM (Abnormal spindle-like microcephaly-associated protein) ，跟纺锤体组装配密切相关，对于有丝分裂和减数分裂中有丝分裂纺锤体的正确组装和排列是必要的。深入研究表明ASPM是决定大脑皮层尺寸发育的关键调节因子, 其突变后显著降低大脑皮层尺寸而诱发小头畸形，然而其发病的分子机制仍不清楚。

DNA复制是细胞最根本的生命活动之一，精准的复制基因组DNA并将其均分给子代细胞是维持我们物种稳定的根本 【4】 。处于复制期的细胞，基因组DNA极易受各种内、外源因素的攻击而造成DNA复制叉停滞及DNA损伤。我们把在基因组复制过程中加诸在复制机器的挑战统称为“复制胁迫”，如DNA自身的化学修饰、高级结构等因素都会造成复制叉的停滞以及不稳定 【4,5】 。另外，内源性因素如氧化应激，外源性因素包括电离辐射等均会攻击DNA造成基因的突变、插入或者缺失，造成基因组不稳定。而基因组不稳定性与一系列人类疾病密切相关，包括癌症、早衰和神经退行性病变等。停滞的复制叉可快速激活蛋白激酶ATR (Ataxia-telangiectasia and Rad3 related)  和周期检验点蛋白激酶CHK1 (checkpoint kinase 1) 级联信号通路来应答复制压力。该通路的激活对于稳定复制叉、激活S期周期检验点和重启停滞的复制叉是至关重要的。

2022年9月27日，深圳大学医学部许兴智教授/彭斌副教授团队在PNAS上发表了题为 ASPM promotes ATR-CHK1 activation and stabilizes stalled replication forks in response to replication stress  的研究论文。 该论文报道了ASPM作为支架蛋白促进TopBP1和RAD9在复制叉上的募集，从而促进了复制胁迫下ATR-CHK1信号轴的活化。同时， ASPM可以募集至阻滞的复制叉，保护新合成DNA链不被核酸酶MRE11降解，从而维持复制叉的稳态，确保基因组的稳定以避免肿瘤等疾病的发生 【11】 。

研究团队利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了FLAG-ASPM knock in (KI) 的细胞系，通过FLAG抗体富集的互作蛋白组进行质谱鉴定，意外发现多个DNA复制相关蛋白。研究发现ASPM对于正常的DNA复制进程没有明显影响，但是影响复制胁迫下ATR-CHK1信号轴的激活。通过细胞和生化层面的实验证实，ASPM在RAD17的下游发挥功能。复制胁迫下ASPM被RAD17募集至阻滞的复制叉上，其N端 （1-919 aa） 作为平台募集TopBP1和RAD9至阻滞的复制叉，而后者是ATR激活的重要激活因子。发现复制胁迫下ASPM缺陷的细胞中阻滞复制叉上新合成DNA链被降解、阻滞的复制叉比率显著增加，而重启的叉明显减少。深入研究发现ASPM募集至阻滞的复制叉上可以拮抗核酸酶MRE11对新生链的降解。此外，还发现ASPM缺陷的细胞对复制胁迫药物羟基脲 （HU） 更为敏感，且显著增加了染色体畸变的比率。因此，ASPM对于复制叉稳态的维持对于后续DNA复制叉的重启和基因组稳定性的维持是至关重要的。

综上所述，通过系列的细胞、生化实验，研究团队发现ASPM的N端919个氨酸及作为支架蛋白介导TopBP1和RAD9在复制叉上的募集，进而确保了复制胁迫下ATR-CHK1信号轴的有效活化。与此同时，还发现ASPM作为一个新合成链的保护因子，拮抗核酸酶MRE11避免被其降解从而维持复制叉的稳态。 这项工作是首次从基因组稳定性的角度揭示先天性小头畸形的致病机理，为先天性小头畸形的防治提供了新的靶点和理论基础。

深圳大学医学部许兴智教授和彭斌副教授为论文的共同通讯作者，许兴智教授团队伍星璇博士和许仕彬博士后为该论文的共同第一作者。

值得一提的是，哈佛大学医学院DNA复制胁迫领域国际著名教授Lee Zou在基因组稳定性专业杂志Genome Instability & Disease最新一期文章中，专门对该项工作发表了题为  Defective replication stress response linked to microcephaly  的评述 【10】 。 文中提到，ASPM不仅促进9-1-1复合物和TopBP1蛋白的募集，还保护了阻滞复制叉上新生DNA链不被降解。强调了复制胁迫的缺陷与先天性小头畸形致病机制存在关联。

据悉，许兴智教授团队长期致力于探讨先天性小头畸形致病基因的功能及其作用机制，首次揭示：1）MCPH1和ASPM是纺锤体蛋白 【6,7】 ；2）MCPH1通过调控BRCA1和CHK1而参与DNA损伤应答 【8】 ，ASPM通过调控BRCA1的稳定性而促进同源重组介导的DNA修复 【9】 ；3）ASPM促进ATR-CHK1检验点的信号传导并稳定阻滞的复制叉，从而避免复制叉的垮塌。基于这些开创性的研究成果，许教授团队提出基因组不稳定性是先天性小头畸形的核心致病机制 【2】 。

许兴智教授长期从事DNA损伤应答与癌症的基础和转化研究，是我国DNA损伤修复领域的核心召集人之一。实验室研究方向为DNA损伤/DNA复制胁迫应答与人类疾病，尤其关注翻译后修饰对协调调控DNA损伤/DNA复制胁迫应答的作用机制及其对放化疗敏感性的调控和靶向基因组稳定性的抗癌先导化合物的开发。现依托在研的国家自然科学基金重大项目等，诚聘博士后2-3名。要求35周岁以下，取得国（境）内外高水平大学或研究机构博士学位不超过3年，有医学、生命科学、药学或有机合成/化学生物学等研究背景均可。待遇优厚（综合年薪44万元起）。

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原文链接：

www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2203783119

制版人：十一

参考文献

1. Okamoto N, Kohmoto T, Naruto T, Masuda K, & Imoto I (2018) Primary microcephaly caused by novel compound heterozygous mutations in ASPM. Hum Genome Var 5:18015.

2. Xu S, Wu X, Peng B, Cao S-L, & Xu X (2020) Primary microcephaly with an unstable genome. Genome Instability & Disease 1(5):235-264.

3. Johnson CA, Wright CE, & Ghashghaei HT (2017) Regulation of cytokinesis during corticogenesis: focus on the midbody. FEBS Lett 591(24):4009-4026.

4. Saxena S & Zou L (2022) Hallmarks of DNA replication stress. Mol Cell 82(12):2298-2314.

5. Liao H, Ji F, Helleday T, & Ying S (2018) Mechanisms for stalled replication fork stabilization: new targets for synthetic lethality strategies in cancer treatments. EMBO Rep 19(9).

6. Zhong X, Pfeifer GP, & Xu X (2006) Microcephalin encodes a centrosomal protein. Cell Cycle 5(4):457-458.

7. Zhong X, Liu L, Zhao A, Pfeifer GP, & Xu X (2005) The abnormal spindle-like, microcephaly-associated (ASPM) gene encodes a centrosomal protein. Cell Cycle 4(9):1227-1229.

8. Xu X, Lee J, & Stern DF (2004) Microcephalin is a DNA damage response protein involved in regulation of CHK1 and BRCA1. J Biol Chem 279(33):34091-34094.

9. Xu S, et al. (2021) ASPM promotes homologous recombination-mediated DNA repair by safeguarding BRCA1 stability. iScience 24(6):102534.

10.   Ajinkya S. Kawale, Lee Zou (2022) Defective replication stress response linked to microcephaly. Genome Instability & Disease. In press

11.    Xingxuan Wu, Shibin Xu, Peipei Wang, Zhao-Qi Wang, Hongxiang Chen, Xingzhi Xu, Bin Peng (2022). "ASPM promotes ATR-CHK1 activation and stabilizes stalled replication forks in response to replication stress." Proc Natl Acad Sci U S A. In press.

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