Nature背靠背 | Cas12a2诱导顿挫感染的新机制——活化后对双链DNA的非特异性降解

撰文 | 木兰之枻

CRISPR系统是原核生物的获得性免疫系统，是细菌抵抗外源病毒感染的有力武器。机制研究指出，多种CRISPR系统能在crRNA的引导下靶向目标RNA，并最终导致顿挫感染的发生 （abortive infection, 细菌免疫系统在外源病毒感染时触发细胞死亡/细胞休眠，最终阻止感染性病毒颗粒的组装和释放保护细菌的机制） 。其中，VI型CRISPR系统能非特异性降解RNA，而Cas13核酸酶则身兼两职：既能在crRNA介导下特异性降解目标RNA，又能作为RNA酶介导RNA的非特异性降解。III型CRISPR系统中，crRNA结合目标RNA并诱导环化寡腺苷酸的产生，进而激活CRISPR复合物的RNA酶和ssDNA酶活性介导各类RNA和ssDNA的非特异性降解，最终导致顿挫感染 （Mol Cell｜细菌大战噬菌体：辅助核酸酶诱导顿挫感染） 【1】 。近年来有研究称III型CRISPR系统还具有dsDNA酶活性能介导dsDNA的非特异性降解，V型Cas12a核酸酶具有ssDNA酶活性能介导ssDNA的非特异性降解导致顿挫感染。不过III型CRISPR系统的dsDNA酶活性和Cas12a的ssDNA酶活性研究依然缺少足够的证据支撑。

2023年1月4日，来自德国亥姆霍兹RNA感染研究所的Chase L. Beisel实验室与美国犹他州立大学Ryan N. Jackson实验室以及美国农业科技公司Benson Hill公司Matthew B. Begemann实验室合作，在Nature发表题为 Cas12a2 elicits abortive infection throughRNA-triggered destruction of dsDNA 的论文。文章对V型Cas12a2核酸酶诱导顿挫感染的机制进行了深入研究。研究 首次证实Cas12a2能通过非特异性降解dsDNA促进顿挫感染的发生，并揭示了详细的作用机制。本研究有效拓展了我们对CRISPR-Cas系统抗病毒免疫机制的认识，并为未来的CRISPR工具开发提供了新的方向。

文章伊始，研究者通过演化分析证实了Cas12a2与Cas12a的同源性。进一步分析指出，Cas12a2与Cas12a的CRISPR重复序列 （CRISPR repeats） 3’末端高度保守，且两种核酸酶具有同源的RuvC功能域和二级结构类似的N末端。不过对应于Cas12a蛋白的BH结构域和Nuc功能域，Cas12a2分别拥有完全不同的未知功能域和锌指结构域。由上可知，Cas12a2和Cas12a或能结合并处理相似的crRNA，但其功能可能有很大不同。为此研究者选取硫氧化ε-变形菌来源的SuCas12a2开展功能和机制研究。质粒干扰实验指出Cas12a2而非Cas12a能通过RuvC功能域介导的顿挫感染发挥抗病毒免疫的功能。

研究发现，Cas12a2介导crRNA加工和成熟的过程与Cas12a类似，且两者的crRNA可互换。机制研究指出，Cas12a2的活化依赖于crRNA与目标RNA的互补结合，进而介导ssRNA、ssDNA和dsDNA的非特异性降解。研究还发现，Cas12a2系统中crRNA对目标RNA的识别依赖于前间隔序列侧翼位点(protospacer flanking sequence, PFS)：目标RNA的3’端有PFS存在时方能被crRNA识别。此外，Cas12a2活化后，不仅可降解线性化的dsDNA，还能快速降解超螺旋的环状dsDNA。

研究者还对可被Cas12a2系统识别的PFS序列进行了分析，发现PFS除富含腺嘌呤外 （A-rich） ，并无其它一致的序列特征，这体现出靶序列的灵活性。研究还发现，Cas12a2对crRNA与目标RNA间的错配有较高的容忍度，单/双碱基错配一般不会影响其相互结合，只有遍布crRNA互补序列的4碱基错配，或者3’末端的10碱基错配才能完全破坏相互结合。此外，CRISPR抑制因子AcrVA也难以抑制Cas12a2的功能：检测的7种AcrVA中，仅AcrVA2.1能部分抑制Cas12a2的功能。以上研究发现的Cas12a2功能与Cas12a差异巨大，提示我们Cas12a2与Cas12a在细菌中的功能很可能存在互补性。

已有研究表明，Cas12a2的活化依赖于crRNA与目标RNA的结合，以及随后对ssRNA、ssDNA和dsDNA的非特异性降解，最终导致顿挫感染。不过顿挫感染的发生机制有多种可能：选择性清除细胞内的所有质粒、导致细胞休眠或细胞死亡。研究指出，Cas12a2并非是通过选择性清除细胞内的所有质粒，而主要是通过诱导细胞休眠导致顿挫感染的发生。研究还发现，Cas12a2介导的dsDNA非特异性降解会导致DNA损伤，进而诱导SOS修复应答机制，最终导致顿挫感染。

最后，研究者还证实，Cas12a2能被改造成为通过ssDNA/ssRNA来特异性检测RNA的分子诊断工具。研究者还利用Cas12a2非特异性降解dsDNA的能力开发出一种以质粒DNA或DNA缺口平移法为基础的检测试剂盒，这为未来的工具研发提供了新的思路。

总体而言， 本研究发现了CRISPR系统诱导顿挫感染的新机制：当cRNA识别并结合目标RNA后，V型CRISPR系统Cas12a2活化，进而介导dsDNA的非特异性降解，最终导致顿挫感染。这一研究让我们对CRISPR-Cas系统诱导顿挫感染实现抗病毒免疫的机制有了更深入和全面的了解和认识。此外Cas12a2被改造成为分子诊断工具的潜力也为未来的工具开发研究提供了新思路。

此外，来自美国德克萨斯大学奥斯汀分校的David W. Taylor实验室与美国犹他州立大学Ryan N. Jackson实验室合作，在同期Nature发表了题为 RNA targeting unleashes indiscriminate nuclease activity of CRISPR–Cas12a2 的论文。文章从结构的角度对Cas12a2活化后介导dsDNA非特异性降解的机制进行了解析。研究指出，正常条件下Cas12a2处于自抑制状态。crRNA与目标RNA结合后，Cas12a2的自抑制状态解除，RuvC功能域暴露，进而通过引导DNA双链扭曲和局部融化而结合双链DNA并最终促进dsDNA的非特异性降解。 这一研究让我们从结构的角度了解了Cas12a2诱导顿挫感染的机制，也为未来Cas12a2的改造和工具开发提供了新的视角。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05559-3

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05560-w

参考文献

1. Mayo-Muñoz D, et al. Type III CRISPR-Cas provides resistance against nucleus-forming jumbo phages via abortive infection. Mol Cell. 2022 Dec 1;82(23):4471-4486.e9.

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