关于重组CHO细胞系的全球磷酸化蛋白质组学研究

在研究CHO细胞的蛋白质组时，考虑翻译后修饰（PTMs）是很重要的，如磷酰化。磷酸化可以作为一个分子开关，使蛋白质磷酸化和去磷酸化。这方面的一个例子是蛋白激酶B，它通过在其Ser和Thr残基的磷酸化后被激活来调节细胞生存。据估计，大约30%的蛋白质在细胞中的任何时候都被磷酸化）。PTMs可以通过氨基酸的共价修饰或蛋白质的裂解而导致蛋白质表型的改变。如果在研究CHO细胞的蛋白质组时考虑磷酸化事件，我们可以更准确地绘制影响我们感兴趣的表型的途径。

如何在以确定CHO细胞工程的潜在性为目标，从而提高产品的滴度和Qp呢？

来自爱尔兰都柏林城市大学和美国礼来公司的科研人员发表了一篇文章Global phosphoproteomicstudy of high/low specific productivity industrially relevant mAb producingrecombinant CHO cell lines， 该研究分说明了这些。

首先，从材料和方法来看。

1. 进行CHO细胞系的批量培养。每个CDCL都在一式两份的培养瓶中，在150rpm、6%的CO2和36°C的条件下进行培养，第4天的温度转变为32°C。细胞在Kuhner摇床ISF1-X（Kuhner）中培养了17天。在第4天、第7天和第10天给细胞喂食礼来公司生产的饲料。如果需要的话，在第12天和第14天也用葡萄糖喂养细胞。使用自动VicellTM XR细胞活力分析仪测定了细胞密度、活力、细胞大小和细胞体积。细胞规格的生产力是用下面描述的计算方法和以前发表的方法测量的。

2. 总蛋白提取和溶液中蛋白消化。   高和低Qp的CDCLs在17天的喂养批次摇床研究中生长，并在培养的第6天和第10天提取细胞颗粒。通过1000克离心5分钟收获细胞颗粒。细胞颗粒用磷酸盐缓冲盐水清洗。使用1mL裂解缓冲液（7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，30mM Tris，pH8.5）裂解2 X 106个细胞，然后在14,000g下离心15分钟，在裂解液中加入0.5M DDT，在56 °C下培养20分钟。用Bradford测定法（Bio-rad）来确定蛋白质浓度。使用过滤器辅助样品制备（FASP）方法和C18肽纯化法制备每个样品100μg用于LC-MS/MS分析。使用1:200的Lys-c和1:100的序列级改性胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）对样品进行消化。

3.磷酸肽的富集和溶液中蛋白质的消化。使用裂解缓冲液（8M尿素、50mMTris、75mM NaCl（pH 8.2）缓冲液，辅以1X Halt蛋白酶inhi- bitors（Thermo Fisher Scientific）裂解细胞颗粒，并按照以前的描述，对每个细胞裂解物进行消化和富集磷酸肽（Kaushik等，2018）。使用1:200的Lys-c和1:100的序列级改性胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）对样品进行消化。

4.LC-MS/MS总计。使用Orbitrap质量分析仪进行扫描，分辨率为120,000（在m/z 200），最大注入时间为50 ms，自动增益控制（AGC）值为4 X 105。顶速采集算法被用来确定所选前体离子的碎裂数量。隔离宽度为1.6 Da，用于在四极杆中隔离选定的前体离子。60秒后对分析的肽进行动态排除，只有电荷状态在2+和7之间的肽才会被排除。用28%的归一化碰撞能量对前游标离子进行碎裂，并对产生的MS/MS离子进行测量。MS/MS扫描条件通常如下：焦耳的AGC值为2 X 104，最大fill时间为35 ms。

5.基因本体论。基因本体（GO）数据库DAVID（https://david.ncifcrf.gov）、TopGene（https://toppgene.cchmc.org）和STRING（https://string- db.org）被用来分析所有差异表达的原蛋白列表。差异表达蛋白的特殊基因符号被输入到基因本体数据库中。这些基因本体数据库被用来识别生物功能和分子过程，这些功能和分子过程在我们的差异表达蛋白列表中被富集。

6.统计分析。对高和低Qp CHO细胞CDCLs之间测量的所有表型参数进行了双尾学生t检验。对所有数据进行了F检验，以确定在学生t检验中应使用相等或不相等的变量。F统计量值低于临界F值表示方差相等，F统计量值高于临界F值表示方差不等。P值≤0.05的数据被认为是低显著性，≤0.005被认为是显著性，≤0.001被认为是高度显著性。

得到的结果

高和低Qp的CDCLs是从工业上相关的表达IgG4的CDCLs中选择的，这些CDCLs是作为一个细胞系开发项目的一部分产生的。这些CDCLs在一个为期17天的喂养批次摇床研究中被培养，并收集样品进行差分LC-MS/MS分析。如果CDCL达到>20pg/cell/day的峰值Qp，则被视为具有高Qp，如果达到<20pg/cell/day的峰值Qp，则被视为具有低Qp。高Qp的CDCLs是基于其高Qp和高滴度而选择的，并且只包括如果他们有较高的存活率和VCD，则在组中（图1）。低Qp的CDCLs是根据其低Qp和滴度选择的，也只有在其具有高存活率和VCD的情况下才被纳入组内（图1）。选择第6天和第10天进行LC-MS/MS分析，因为高和低Qp的CDCL在这些时间点都保持着较高的生存能力和VCD。所有CDCL的生存能力和VCD在第10天后开始下降。第6天代表生长的早期指数阶段，第10天代表生长的固定阶段。

除了滴度、Qp、存活率和VCD外，所有CDCLs都有许多特性，可以选择在其他表型特征方面相似的CDCLs，以便在进行Qp比较时有一个更干净的背景。另外两个可能很重要的、在统计学上有显著差异的参数是

1）总细胞密度（TCD）（图1E），在第10天，低Qp CDCLs的细胞密度明显升高。2）综合存活细胞密度（IVCD）（图1F）也被发现在第10天和第14天低Qp CDCLs中明显较高，这表明在这些时间点低Qp CDCLs中存活细胞的积累较高。在所选择的细胞系之间没有观察到细胞体积9（补充图1A）、细胞大小（补充图1B）、转录本拷贝数（补充图1C）或基因拷贝数（补充图1D）的统计学意义上的差异，这使得我们在蛋白质组和磷蛋白组中观察到的差异更可能参与生产力表型。尽管在高Qp的CDCLs中，基因拷贝数有增加的趋势，但由于高Qp的CDCLs之间基因拷贝数的高度差异，这在统计学上不具有显著性。在整个培养过程中，还对细胞的废物和代谢物进行了测量。在乳酸（补充图2A）、氨（补充图2B）、谷氨酰胺（补充图2C）、葡萄糖（补充图2D）或谷氨酸（补充图2E）中没有观察到高和低Qp CDCLs之间的显著差异。

在培养的第6天和第10天，从高和低Qp CDCLs中取样进行定量差分LC-MS/MS分析。使用总蛋白LC-MS/MS分析，每个样品中有超过4000个总蛋白被识别出来。然后用无标签的LC-MS/MS分析来确定高和低Qp CDCLs之间有差异表达的总蛋白。差异表达的总蛋白列表被确定为只包括由2个或更多的独特肽识别的蛋白质，其折叠变化为>1.5，方差分析为<0.05。在第6天，确定了137个符合这些标准的不同表达的总蛋白，其中75个蛋白的表达量增加，61个蛋白在高QpCDCLs中表达量减少。在第10天，确定了189个不同表达的总蛋白，其中87个表达量增加，101个蛋白在高QpCDCLs中表达量减少。我们确定了30种在第6天和第10天都有不同表达的蛋白质。在这两个时间点上，还发现与tRNA氨基酰化促进蛋白质翻译有关的蛋白质有不同的表达（表1）。本研究中确定的所有差异表达的总蛋白和磷蛋白都列在表2中。

在这项研究中，他们还确定了其他几种与翻译相关的磷蛋白和总蛋白，它们在高和低Qp CDCL之间有不同的表达（表3）。其中许多蛋白与细胞增殖和有丝分裂的细胞周期有特殊关系，在高Qp的CDCLs中表达减少。

与高Qp的CDCLs相比，这些CDCLs可能具有较低的Qp，这是因为它们将其翻译机器引向翻译细胞周期相关的mRNA，尽管就其VCD而言，细胞似乎并没有收获这种回报。然而，低Qp的CDCL确实显示出明显较高的TCD和第10天以及较高的IVCD在第10和14天。这些蛋白质和磷蛋白可以作为高Qp CHO细胞系的细胞工程的潜在目标而被进一步研究。减少这些蛋白质在CHO细胞系中的表达，可以释放出翻译机器，使其专注于翻译重组的蛋白质产品。例如，EIF4G1在Ser-1224的磷酸化可以使用基因组工程工具，如CRISPR/Cas9，以确定该磷酸基点的特定功能。诸如RPL12和NCL这样的磷蛋白也可以成为敲除的目标，试图释放翻译能力，使重组蛋白的翻译增加。这里介绍的结果还表明，减少这些蛋白的表达对细胞的生长几乎没有负面影响，这在重组蛋白生产中是非常理想的。

该研究对高/低Qp工业相关的CHO细胞系进行了全面的磷蛋白组学调查，这些细胞系在表型水平上已被全面描述。这些结果确定了高和低Qp CHO CDCLs之间差异性表达的蛋白质，可以进一步研究其作为合理工程CHO细胞系的潜在目标，以实现高规格的生产。与氨基酸可用性相关的蛋白质被证明在高Qp CHO CDCLs中表达增加。发现GCN2在Thr-727的磷酸化在高Qp的CDCLs中有所增加。GCN2的磷酸化已被归因于许多细胞功能，包括对压力的反应；然而，这里检测到的Thr-727磷酸化的作用是未知的。本研究的结果还表明，低Qp CDCLs的一个主要特征是高水平的mRNA转录，这促进了细胞周期的进展，尽管这种好处在低Qp CDCLs的VCD中没有体现出来。

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