Cell Metab | 代谢重编程诱导阿尔茨海默病神经元病变的代谢和转录调控新机制

撰文 | 阿童木

责编 | 兮

由于预期寿命的不断延长，人口老龄化已成为全球性的严峻社会性问题，联合国和美国CDC预测2030年全球老龄化人口 （65岁以上） 数量将攀升到近10亿，其中发展中国家的人口老龄化现象将尤为严重。阿尔茨海默病 （ AD ） 是一种老年人口中较为普遍的进行性神经退行性疾病，表现为神经元凋亡和突触丧失、脑萎缩和甚至死亡，AD患者的记忆力和认知力下降，严重影响患者的生存质量 【1】 。近几十年来，有关AD发生机制及治疗策略的基础和临床研究层出不穷，但AD发生过程中神经元病变的代谢和细胞性机制仍未完全清楚。

近年来，除了以突触连接退化和进行性神经元死亡为特征的AD的典型特征外，一些以蛋白质组学和代谢组学为手段的研究鉴定到了AD发生中的重要剪接和代谢调控的缺陷，例如脑脊液中一些代谢酶 （如LDHA和PKM） 的表达水平上升已被认为是AD的重要指标 【2,3】 。

8月19日，奥地利Leopold-Franzens大学 Larissa Traxler 和Jerome Mertens领衔在Cell Metabolism杂志发表了题为 Warburg-like metabolic transformation underlies neuronal degeneration in sporadic Alzheimer’s disease  的研究文章，发现 肌肉型丙酮酸激酶（PKM）编码基因的可变剪接体PKM2在AD患者的脑组织及患者来源的诱导神经元（iNs）中表达异常上升，PKM2会诱发AD iNs发生与肿瘤细胞类似的Warburg效应而促进糖酵解，且PKM2通过增强核转位并诱导STAT3和HIF1α等转录因子的表达而导致AD患者iNs的命运丧失和细胞凋亡，而抑制PKM2可以在一定程度上缓解AD iNs的代谢异常，阻滞PKM2的核转位，从而恢复AD患者神经元的正常功能。本研究揭示了代谢酶和表观调控因子PKM2在AD神经元病变中诱导代谢重编程及对转录网络的表观调控机制，为AD治疗提供了潜在的重要药物靶点。

之前研究中，为了更全面地了解AD患者神经元中潜在的转录和代谢变异，作者通过过表达两种先驱转录因子Ascl1和Ngn2将AD患者来源的成纤维细胞直接转化为诱导神经元 ( iNs ，induced neurons) ，并证明iNs具有与供体相同的衰老特征，是探究人类神经元衰老相关病变的理想模型 【4】 。利用转分化的iNs模型，作者发现AD患者来源的iNs 与癌症的恶性转化相似，会失去成熟的神经元标志物并回归到未成熟状态。由于AD的诸多特征与代谢稳态紊乱密切相关，因此神经元代谢很可能是控制AD iNs成熟性转换及AD病理性反应的核心机制。

本研究伊始，作者通过分离AD患者及相应的非AD患者的穿孔活检和真皮成纤维细胞培养物，并过表达Ascl1:2A:Ngn2，诱导供体成纤维细胞转化为皮质iNs。21天后大多数成纤维细胞具有成熟的神经元形态，作者根据神经元表面标记物PSA-NCAM的表达，采用FACS分离了成功转化的iNs。

iNs细胞模型构建成功后，作者通过加权基因相关网络分析 (WGCNA) 及基因集富集分析 （GSEA） 探究了AD发生对iNs基因表达模式的影响，发现6个与AD发生及认知能力改变有关的基因模块 （Uniport和KEGG terms） 在两类iNs中存在差异。接下来作者利用来自AD患者和对照的海马组织样本的转录组数据，比较探究了iNs中AD相关的基因模块差异在多大程度上反映了体内状态下的相应状况。正如预期所料，一些与代谢有关的基因模块在AD患者及AD患者来源的iNs中发生了异常，进一步鉴定导致iNs产生AD特征及基因模块差异的具体代谢调控因子后，作者发现肌肉型丙酮酸激酶 （PKM） 的编码基因所涉及的差异化基因模块最多。PKM是研究最多的丙酮酸激酶同工酶，催化糖酵解的最后一步反应，PKM是Warburg效应的关键介质之一，是调控肿瘤代谢的关键酶，也是肿瘤发生中导致恶性表观遗传转化的核因子 （特别关注丨丙酮酸激酶M1型和M2型（PKM1/2）研究的戏剧性逆转和对Warburg效应的反思） 。 PKM编码基因可以通过对mRNA的选择性剪接第9或第10外显子而分别表达PKM1和PKM2两种同工酶。PKM1和PKM2的表达和功能存在差异：PKM1主要在肌肉和脑这些对能量需求旺盛的分化终末细胞中表达，代谢活性强，有利于丙酮酸合成及线粒体OXPHOS，而PKM2则主要在肿瘤细胞等对合成代谢需求强的组织细胞中表达，与Warburg效应有关，代谢调节活性较弱 。作者因此推测涉及PKM的异常代谢和表观遗传调控可能会驱动AD神经元的病理性性改变。

接下来作者探究了PKM在AD神经元病变中的作用。首先，作者发现PKM虽然是AD iNs “基因模块-性状-关联性”分析中挖掘到的枢纽基因，但AD iNs中PKM的总mRNA水平并未发生变化，有趣的是AD iNs中PKM2这一剪接形式的表达水平上升，PKM2/PKM1比例增加。其次，与对照iNs相比，AD iNs的PKM代谢活性显著降低，且与糖代谢尤其是糖酵解有关的代谢物在AD iNs和正常iNs中差异显著，AD iNs中糖酵解酶类活性上调（GLUT3、HK2和LDHA等），糖酵解代谢物丰度上升（6-磷酸葡萄糖、PEP和乳酸等），代表着AD iNs发生了类似肿瘤细胞中Warburg代谢转换。第三，与大部分肿瘤细胞类似，AD iNs的Warburg转换并没有伴随着线粒体功能失调，乳酸产量的增加并未以牺牲TCA循环的功能为代价，AD iNs能够维持线粒体氧化代谢并增加葡萄糖消耗，以促进糖酵解高于正常水平。因此，AD iNs中PKM2剪接体的表达上调会导致AD iNs发生与肿瘤细胞类似的Warberg样代谢转换，糖酵解活性异常上升。

PKM1形成不能进入细胞核的四聚体复合物，而PKM2形成能够入核的二聚体，因此除了导致PKM的代谢活性降低外，PKM选择性剪接的PKM2偏好性还会促进PKM的核转位。通过检测PKM2的表达及活性变化，作者发现AD iNs细胞核中PKM2的表达和核内激酶活性上升。ATAC-seq和ChIP-seq数据表明AD iNs中转录因子HIF1α和STAT3调控区域的染色质开放性增加，且调控基因的表达上调。GSEA分析揭示了PKM2::HIF1a 诱导的基因参与了前体代谢物的产生以及能量和碳水化合物的代谢过程，而PKM2::STAT3诱导的基因促进了损伤信号传导、细胞因子活性和细胞凋亡。因此，AD iNs中PKM2剪接体的表达上调不仅导致了AD iNs的代谢重编程，还通过核转位的增强而重构了iNs的表观及转录调控程序，如细胞凋亡和能量代谢。

晚期AD的特征是神经元的广泛性细胞死亡，成熟的神经元能够有效抑制凋亡，以避免神经元的非病理性损失，而神经元向未成熟状态去分化可能会破坏凋亡抑制程序，从而导致AD的发生。利用凋亡诱导物ABT737处理AD iNs并检测凋亡标记物表达，作者发现凋亡细胞的增加的比例与糖酵解中间代谢物增加的比例呈现显著的相关性，即iNs中的代谢转换与细胞凋亡程度直接相关。接下来作者探究了AD iNs的代谢转变与细胞凋亡间的因果关系，发现虽然其他类型细胞中Warburg效应和凋亡逃逸相关，但神经元为应对有氧糖酵解的代谢重编程，其对凋亡刺激的反应能力增强，进而加剧了AD发生时神经元的细胞凋亡。

鉴于PKM2在许多癌症发生中的关键作用，目前已开发出诱导PKM2形成四聚体而无法入核的PKM2抑制剂 （如Shikonin） ，以降低有氧糖酵解和PKM2的核转移，从而抑制癌症的发生 【5】 。那么，PKM2抑制剂能否通过抑制PKM2的核转移而缓解AD发生时的神经元病变呢？首先，作者发现PKM2抑制剂处理能够抑制iNs中PKM2的核转移，并显著降低AD iNs中PKM2的表达。其次，PKM2抑制剂处理能够降低AD iNs中糖酵解代谢物的积累，促进乳酸分泌和NAD⁺合成恢复到正常水平。第三，转录组分析发现PKM2抑制剂处理会诱导AD iNs的转录模式趋近于正常的iNs，并通过抑制致癌转化和凋亡相关基因的表达而缓解了AD iNs中存在的癌症转化样未成熟的转录组特征，恢复了与成熟突触特性相关的正常基因表达模式。第四，PKM2抑制剂处理会明显降低凋亡神经元的数量。因此，抑制PKM2活性能够恢复AD iNs的转录和代谢稳态，抑制神经元凋亡，促进其恢复成熟神经元的正常功能。

综上所述， 本研究利用诱导神经元（iNs）模型，发现AD患者iNs中PKM2剪接体表达上升会诱导iNs有氧糖酵解活性增强，发生类似Warburg效应的代谢重编程；并促进PKM2的核转位诱导关键转录因子的表达而导致神经元命运丧失和细胞凋亡的发生。而抑制PKM2活性能够恢复AD神经元的代谢，阻滞PKM2的核转位而抑制凋亡调控基因的表达，缓解AD神经元病变。本研究为以PKM2为靶点研发AD治疗药物提供了新的思路和理论支撑。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.07.014

制版人： 十一

参考文献

1. Veitch D P., et al. (2019). Understanding disease progression and improving Alzheimer's disease clinical trials: Recent highlights from the Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. Alzheimer's & Dementia 15(1): 106-152.

2.  Bai, B., et al. (2020). Deep multilayer brain proteomics identifies molecular networks in Alzheimer’s disease progression. Neuron 105, 975– 991.e7.

3. Johnson, E.C.B., et al. (2020). Large-scale proteomic analysis of Alzheimer’s disease brain and cerebrospinal fluid reveals early changes in energy metabolism associated with microglia and astrocyte activation. Nat. Med. 26, 769–780.

4. Mertens, J., et al. (2021). Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer’s patients. Cell Stem Cell 28, 1533–1548.e6.

5. Zhao, X., et al. (2018). Shikonin inhibits tumor growth in mice by suppressing pyruvate kinase M2-mediated aerobic glycolysis. Sci. Rep. 8, 14517.

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