​Sci Adv丨单分子研究揭示 PARP抑制剂对PARP1在DNA上滞留的调控机制

多聚腺苷二磷酸核糖基化修饰 （Poly-ADP-ribosylation, PARylation） 是一种由PARP催化的蛋白质翻译后修饰。在DNA损伤应答中，PARP1作为DNA损伤的感应蛋白 （sensor） 负责DNA损伤修复中80~90% 的PARylation 【1, 2】 。PARP抑制剂是首类基于“合成致死”原理开发的抗癌药物，现已有四种PARP抑制剂 （talazoparib，olaparib， niraparib，rucaparib） 获批用于乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等因BRCA1/2突变导致的同源重组缺失的癌症治疗【3】。

PARP1是一个多结构域蛋白 （图1A） 。当发生DNA损伤时，PARP1会首先识别并结合到损伤位点；与损伤的DNA结合后，PARP1会产生变构效应 （allosteric effect） 。原本处于闭合状态的HD会打开，从而允许其底物NAD⁺进入PARP1的催化口袋 （图1B） 。激活的PARP1聚合酶通过水解NAD⁺，将ADP加载到其自我修饰结构域 (BRCT) 或者其它蛋白、DNA上，对其底物进行修饰。由于多聚腺苷二磷酸核糖 （poly-ADP ribose, PAR） 带有很高的负电荷，所以PARP1的自我修饰会促使其从DNA损伤位点释放 （图1B） 。

图1

目前临床相关的PARP抑制剂均为NAD⁺类似物，最初的设计是基于它们与NAD⁺竞争结合位点抑制PARP1的PARylation活性。2012年，有研究组提出PARP抑制剂通过PARP1 捕获 (PARP1 trapping) 产生细胞毒性的假设【4】。PARP1捕获是指：1.）PARP抑制剂通过抑制PARP1的自我修饰，阻止其从损伤DNA上快速解离；2.）结合在PARP1催化结构域的PARP抑制剂会通过变构效应进一步阻止PARP1的解离【5】。过去十年，关于PARP抑制剂的作用机理一直存在着争议【4-9】。对于临床相关的PARP抑制剂竞争结合在PARP1催化位点后，是否会进一步通过变构调节影响PARP1在损伤DNA上的滞留，以及催化抑制和变构调节在PARP抑制剂效力（potency）中的贡献情况没有被完全理解。

2022年9月7日，纽约大学医学院 Eli Rothenberg 教授课题组和辉瑞肿瘤研究与开发部Todd L. VanArsdale博士研究团队合作在Science  Advances发表了题为 A two-step mechanism governing PARP1-DNA retention by PARP inhibitors 的研究论文。 研究人员在单分子水平上清楚地“看”到了PARP抑制剂通过两步机制对PARP1在DNA损伤位点的滞留进行调控：PARP抑制剂介导的催化抑制（catalytic inhibition）及其结合PARP1后引起的变构调节（allosteric modulation）。

为了观测PARP1在DNA损伤位点结合和解离的动态过程，研究人员首先建立了基于全内反射荧光显微术的单分子共定位实验体系。研究人员设计了含有单碱基缺口的的双链DNA （SSB-DNA） 模拟DNA 单链断裂 （single-strand break） 损伤 （图2A） ，没有缺口的双链DNA作为对照 （CTRL-DNA） 。CF647标记的Halo-PARP1融合蛋白与Cy3标记的DNA的单分子共定位实验结果显示，PARP1能够特异性地结合SSB-DNA （图2B） 。研究人员进一步分析了单个PARP1分子的时空轨迹 （trajectory） 并将其分为两类：持续性结合 （persistent binding） 和间歇性结合 （intermittent binding） （图2C） 。通过比较野生型PARP1 和 突变蛋白R591A的单分子时空轨迹，研究人员将持续性结合的PARP1所占的比例定义为监测PARP在SSB-DNA上滞留效率 （PARP1 retention efficiency） 的定量指标。

图2

利用建立的单分子实验体系，研究人员首先在没有NAD⁺、含有高浓度PARP抑制剂 （以确保所有结合SSB-DNA的PARP1分子都结合有PARP抑制剂） 的条件下，观测了各种PARP抑制剂如何通过诱导变构效应调节PARP1在SSB-DNA上的滞留。与近期的研究结果一致(6), 单分子实验结果显示veliparib，rucaparib和niraparib会促使PARP1从损伤DNA上解离。单分子实验结果明确了talazoparib、olaparib会轻微促进PARP1在损伤DNA上的滞留。研究人员进而利用PARP1 突变蛋白D766/770A对结果进行了确认；利用R591A和W318R，对变构效应的调节机制进行了解析。

然后，研究人员在单分子实验体系里加入了接近细胞生理浓度的NAD⁺以模拟细胞内的情景。实验结果显示，在NAD⁺浓度一定的情况下，PARP1在SSB-DNA上的滞留效率随着PARP抑制剂浓度的增加而增加，这表明PARP抑制剂通过与NAD⁺竞争结合位点、抑制PARylation，从而促进PARP1在SSB-DNA的滞留。虽然olaparib和talazoparib对PARP1在SSB-DNA上的滞留具有相似的变构调节能力，但在NAD⁺存在的条件下，talazoparib显示出了最强的PARP1滞留效力。结合D766/770A突变蛋白的实验结果，研究人员得出目前临床相关的PARP抑制剂介导的滞留效力主要取决于催化抑制的结论。

综上，单分子研究结果清晰地揭示了临床相关的PARP抑制剂通过两步偶联的机制对PARP1在损伤DNA上的滞留进行调节 （图3） ：1.）催化抑制，即PARP抑制剂通过抑制PARP1的自我修饰阻止其从损伤DNA上快速解离；2.）变构调节，即结合在PARP1催化结构域的PARP抑制剂会通过变构效应进一步对PARP1在损伤DNA上的滞留进行调节，一些PARP抑制剂促进PARP1的滞留，另一些PARP抑制剂促进其释放。目前临床相关的抗肿瘤PARP抑制剂介导的滞留效力主要由第一步催化抑制所决定。该研究为今后开发更有效力的PARP抑制剂提供了理论基础。

图3

辉瑞肿瘤研究与开发部Todd L. VanArsdale博士和纽约大学医学院Eli Rothenberg 教授为该论文的共同通讯作者，Rothenberg课题组薛慧君为第一作者。Rothenberg课题组Amit Bhardwaj, 尹延东 （现为深圳湾实验室特聘研究员） , Carel Fijen, Anastasiya Ephstein，VanArsdale团队 Lianglin Zhang （张亮林） , Xia Ding以及加拿大蒙特利尔大学 John M. Pascal教授为该工作 的完成做出了贡献。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/sciadv.abq0414

制版人：十一

参考文献

1. T. Kamaletdinova, Z. Fanaei-Kahrani, Z. Q. Wang, The Enigmatic Function of PARP1: From PARylation Activity to PAR Readers. Cells 8,  (2019).

2. A. Ray Chaudhuri, A. Nussenzweig, The multifaceted roles of PARP1 in DNA repair and chromatin remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 610-621 (2017).

3. M. Yi et al., Advances and perspectives of PARP inhibitors. Exp Hematol Oncol 8, 29 (2019).

4. J. Murai et al., Trapping of PARP1 and PARP2 by Clinical PARP Inhibitors. Cancer Res 72, 5588-5599 (2012).

5. Y. Pommier, M. J. O’Connor, J. de Bono, Laying a trap to kill cancer cells: PARP inhibitors and their mechanisms of action. Sci Transl Med 8, 362ps317 (2016).

6. L. Zandarashvili et al., Structural basis for allosteric PARP-1 retention on DNA breaks. Science 368,  (2020).

7. T. A. Hopkins et al., Mechanistic Dissection of PARP1 Trapping and the Impact on In Vivo Tolerability and Efficacy of PARP Inhibitors. Mol Cancer Res 13, 1465-1477 (2015).

8. J. Rudolph, J. Mahadevan, P. Dyer, K. Luger, Poly(ADP-ribose) polymerase 1 searches DNA via a ‘monkey bar’ mechanism. eLife 7, e37818 (2018).

9. Z. Shao et al., Clinical PARP inhibitors do not abrogate PARP1 exchange at DNA damage sites in vivo. Nucleic Acids Res 48, 9694-9709 (2020).

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