​Science | HIV-1基质和囊膜成熟的结构机制

撰文 | 望夜

责编 | 酶美

Gag蛋白是HIV-1的主要结构蛋白，在病毒组装过程中被招募至宿主细胞膜处，该过程主要是通过其基质结构域（MA）完成的，然后被酶切成熟从而促进病毒结构成熟以便病毒进行下一轮的入侵。

HIV-1的组装和出芽始于质膜处，主要由55kD大小的Gag蛋白介导。Gag由多个结构域构成（图1）：位于N端的MA结构域，主要负责招募至质膜处；衣壳蛋白（CA）结构域，通过蛋白-蛋白相互作用促进Gag蛋白的自主装；核衣壳（NC）结构域，用于招募病毒RNA基因组至组装处；另外还有几个小肽结构域。通过蛋白-蛋白、蛋白-脂质、蛋白-RNA间相互作用，Gag蛋白在组装点处聚集，引起膜弯曲，继而释放由囊膜包裹的未成熟HIV-1病毒颗粒。一旦释放或者遇到病毒蛋白酶，Gag蛋白会在多个位点被切割，发生结构重构以便病毒入侵下一个靶细胞。病毒粒子成熟过程中，核衣壳和RNA聚集组成核蛋白复合体（RNP），RNP进一步被圆锥形的衣壳蛋白包裹。成熟状态下的MA蛋白被认为依然与病毒囊膜结合。重构后的HIV-1囊膜糖蛋白可用于介导病毒膜融合。

图1 未成熟和成熟状态HIV-1的Gag蛋白结构简图（此图来源于文章，下同）

异源表达的17kD MA的结构已获得过解析，呈小的折叠型构象，由五个α螺旋和一个310螺旋组成。MA在结晶状态下为三聚体形式，在人工单层质膜上可进一步多聚化形成六聚化的三聚体网格，且在六次轴处存在一个空洞；有研究认为这些空洞为HIV-1囊膜蛋白（Env）的C端尾巴提供了结合位点，并促进Env蛋白整合入组装中的病毒颗粒。

病毒囊膜对Gag蛋白的招募是通过其MA结构域N端的豆蔻酰基团及一个高度碱性的（HBR）片段介导的。N端的豆蔻酰处于两种状态间的平衡——或者约束于MA结构域的脂质口袋中或者呈暴露构象，两者间的转换又被称为“豆蔻酰开关”。MA蛋白的三聚化可促进豆蔻酰呈暴露状态。此外，质膜中的磷脂酰肌醇二磷酸（PI（4,5）P₂）也是Gag准确靶向并在膜上正确停留所必需的。早期曾认为PI（4,5）P₂是通过其2’-酰基插入MA上的口袋从而促进豆蔻酰的暴露并插入脂双层中，但后续研究发现PI（4,5）P₂头部基团及膜朝向的HBR区更可能与膜互作相关。MA蛋白还通过其HBR区与胞浆中的核酸发生相互作用，特别是tRNA。这些观察支持一个模型，即PI（4,5）P₂的头部基团与核酸的交换促进了豆蔻酰基团的暴露从而在病毒组装过程中稳定其与膜的结合。

MA的已知功能主要在病毒粒子组装过程中，在病毒入侵和入侵后阶段暂未发现其功能。而MA如何在病毒粒子组装过程中发挥作用也受限于病毒粒子内部MA结构信息的缺失。为此，2021年8月6日，英国MRC的John A. G. Briggs实验室在Science杂志发表题为Maturation of the matrix and viral membrane of HIV-1研究报告，利用冷冻电镜断层重构技术成功解析了HIV-1非成熟和成熟状态的病毒粒子结构，揭示两种状态下MA结构域的结构和组织形式变化，拓宽了对Gag在病毒粒子成熟和膜组分变化中的作用。

在未成熟状态下，MA的螺旋1和2与膜大致呈平行状态并形成一个富含带电和疏水氨基酸的接触面。MA三聚体通过两两间的N端残基组装成一种网格。作者未在PI（4,5）P₂结合MA处观察到脂质的密度，这一观察支持目前认为的PI（4,5）P₂通过其头部基团与MA近膜面的相互作用决定MA蛋白与质膜的有效靶向。在豆蔻酰口袋中未观察到密度，因此构象平衡朝着开放、膜插入的构象转换，这与MA发生寡聚化时豆蔻酰呈暴露状态是一致的。MA螺旋5的C端朝向病毒粒子的中心，其与CA层被一段不规则的酶切位点区所隔开，因此两者无法直接接触。在此状态下，尽管MA形成了有空洞的网格形式，但在孔中未发现Env尾部的密度。

在成熟状态时，MA三聚体也形成了六聚化的网格形式，但其组织方式的规则度更高。而且两种状态下MA的组织形式也有明显差别，表明MA蛋白经历了一个结构成熟过程，形成了一种新的、不同的六聚化网格。通过比较不同状态下病毒颗粒中的CA和MA结构，作者认为分析，MA的结构成熟与HIV-1具备入侵能力相关，因为此时Env已经重新分布于病毒粒子表面。此外，与非成熟状态下MA的HBR区朝向六次轴中心从而形成一个碱性环绕不同，成熟状态下MA的六次轴空洞周围主要分布的是中性氨基酸，这种变化可以影响Env尾部的结构变化进而影响其分布与融合能力的变化。此时，HBR的碱性残基朝向螺旋4 N端及相邻MA单体的3₁₀螺旋上的酸性残基，这就形成了三聚体两两结合面上的相互作用。同时，MA上与HBR区相邻的PI（4,5）P₂结合口袋朝向上述结合面中心。此外，螺旋1的N端插入质膜中，表明此时豆蔻酰基团仍然呈暴露状态并插入膜中。

图2 未成熟（左侧）与成熟（右侧）状态下MA网格的结构对比

此外，作者还对MA蛋白与PI（4,5）P₂的相互作用进行了生化实验验证。作者利用重氮甲烷取代的PI（4,5）P₂衍生物与成熟和未成熟状态的病毒粒子进行结合，发现在光激活时，衍生物仅可有效交联未成熟状态病毒粒子的Gag蛋白，这就证明MA结构域与PI（4,5）P₂存在直接相互作用，而当Gag被酶切成熟后MA的结合位点发生构象变化。

综合两种状态下的结构数据，作者认为在HIV-1成熟过程中经过了明显的构象变化从而形成了不同的网格形式：在未成熟状态下，MA三聚体通过其N末端组装成一个较不规则的六聚化网格，其中包含一个富含碱性残基的空洞和不规则区域用于结合Env的胞质尾部区。N端的豆蔻酰基团在两种状态下基本都插入膜内。在成熟状态下，MA三聚体通过其HBR区组装成高度规则的六聚化网格，此时的空洞主要由中性氨基酸组成。在成熟过程中MA蛋白的构象和其脂质结合状态均发生变化，在成熟状态下MA的脂质结合口袋被高度疑似PI(4,5)P₂的脂类占据，且其一个酰基被从膜中移除。尽管无法确认脂质的类别，作者推测在Gag成熟过程中，病毒囊膜内层约15万脂质分子中的约2500个会被移除。

总的来说，作者通过冷冻电镜断层重构数据分析发现，在HIV-1病毒粒子成熟过程中，Gag不仅浓缩RNP并促进病毒衣壳核心的组装，还通过膜结合的MA结构域的结构重构调节其囊膜脂双层的组成。尽管仍有细节有待进一步研究，但作者认为这一构象变化不仅影响MA和Env的功能，还可影响病毒囊膜的物理特征，这可能与此前观察到病毒粒子刚性（stiffness）降低相关。此外，MA在成熟状态下的规则组织形式暗示其在病毒粒子成熟和入侵后阶段可能也可发挥作用。作者还推测PI(4,5)P₂在膜融合后可能依然保持与膜的相互作用发挥诸如促进病毒复制的信号等作用。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.abe6821

制版人：十一

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